полная версия

Евгений Зеленский
Фарма.РФ. Как отечественные компании создают лекарства будущего уже сегодня

Полная версия

Как сделать вакцину?

Можно начать с вакцин – ведь в предыдущей главе мы как раз обсуждали успехи российской фармы, продемонстрированные в период COVID-19. При создании вакцин используются как раз методы биотехнологий.

Например, вакцины могут быть клеточными. В этом случае в качестве материала для вакцины используется специально отобранная бактерия, которая в норме может даже жить в нашем организме, или аналогичный микроорганизм, который вызывает только лёгкую, не опасную инфекцию. Такие микроорганизмы можно генетически модифицировать, добившись, например, эффекта, при котором наша иммунная система увидит в них более серьезную угрозу, чем есть на самом деле, а попутно обучится защищаться. Такие вакцины еще называются живыми аттенуированными вакцинами, (аттенуировать – ослаблять). Разумеется, чтобы уменьшить риски для прививаемого человека. Для этого микроорганизм могут подвергать различным неблагоприятным для него факторам или культивировать в тяжелой для бактерии среде, чтобы значительно ослабить. Ведь антигены, с которыми нужно познакомить иммунитет, останутся на поверхности бактериальной клетки теми же самыми, а вот сил на заражение организма уже не останется. Вакцины такого типа созданы в частности против оспы, полиомиелита, кори, паротита, краснухи, желтой лихорадки и некоторых других заболеваний. Одной же из самых известных живых аттенуированных вакцин является БЦЖ, помогающая в защите от туберкулеза^5,6. Именно от нее, кстати, на левом плече остается след после прививки в детстве, характерный рубец округлой формы.

Также существует технология производства вакцин с помощью инженерных вирусов. Работает это примерно следующим образом – в ДНК вируса добавляют нужные новые фрагменты, после чего, изменённый генно-инженерным путем, вирус может продуцировать ряд чужеродных белков, с помощью которых и удается обеспечить защиту от инфекционного заболевания.

Не менее технологичны и в чем-то похожи в своем создании ДНК-вакцины. Для их создания отбираются нужные фрагменты ДНК, кодирующие чужеродные белки. Затем к ним добавляются последовательности белков, которые могут усиливать иммунный ответ, после чего материал объединяют и обрабатывают. Получается плазмида, которая вместе с вакциной проникает в организм во время прививки. Плазмида встраивается в клетку и может синтезировать чужеродные белки, вызывая иммунный ответ⁷.

Созданием высокотехнологичных вакцин в нашей стране, помимо тех научных учреждений и компаний, которым мы уже посвятили время в главе об инфекционных заболеваниях, занимается, инновационная компания «Микроген».

Эта компания является крупнейшим национальным производителем иммунобиологических препаратов. Обладая высоким научным и производственным потенциалом «Микроген» занимает лидирующее положение в отрасли – производит продукцию по полному циклу из отечественного сырья, разрабатывает и, конечно, активно проводит исследования новых лекарственных средств.

За последние пять лет, к примеру, специалисты компании разработали целый ряд инновационных отечественных продуктов. Сюда можно отнести трехвалентную вакцину «Совигрипп», применяющуюся для профилактики населения от гриппа в рамках Национального календаря профилактических прививок. Кроме клинических исследований при создании этой вакцины были проведены три многоцентровые масштабные наблюдательные программы в которых приняли участие около 15000 человек.

Это очень солидная выборка!

Также, на текущий момент завершены клинические испытания первой культуральной живой комбинированной вакцины «Вактривир», способной защищать сразу от трех заболеваний. От кори, паротита и краснухи.

Представьте, насколько это удобнее для прививаемого, по сравнению с тремя отдельными введениями!

Такая вакцина будет готовиться как раз методом культивирования аттенуированного штамма вируса на первичной культуре клеток эмбрионов перепелов, что исключит вероятность развития аллергии на куриный белок, с которой иногда сталкивались ранее.

В целом же в портфеле «Микроген» почти два десятка различных вакцин и их число неуклонно растет. А сами вакцины – лишь малая часть от того, чем занимается эта крупная компания, также производя бактериофаги (кстати это единственный официальный производитель таких биопрепаратов в стране), ботулотоксин для использования в косметологии и многие другие препараты⁸.

Молекулярная инженерия – переписывая код

Одни из самых захватывающих примеров развития и использования медицинских биотехнологий нашего времени вершатся в области молекулярной инженерии.

В целом – это наука, которая занимается изучением и изменением последовательности ДНК, то есть той самой цепочки нуклеотидов, в которой двойной спиралью зашифрована наша генетическая информация. Пользуясь широким инструментарием молекулярных технологий, генная инженерия способна вырезать и встраивать в ДНК клеток нужную генетическую информацию.

Но как же это работает?

Первым исследованием, показавшим возможность активного внедрения в генетический аппарат эукариот (клеток, имеющих ядро), стали работы, проведенные американским ученым Брайаном Сауэром еще в далеком для такой инновационной темы 1987 году. В то время была использована так называемая Cre-Lox-опосредованная рекомбинация, в ходе которой удалось разрезать целевые участки ДНК с помощью специального фермента Cre-рекомбиназы. Но с ранними методами редактирования генома возникло много сложностей, они были очень дорогими и трудоемкими. А заодно, часто и недостаточно точными. Часть этих проблем удалось разрешить уже только в XXI веке.

Современные биотехнологи разрабатывают три основных системы редактирования генов. Первой и самой нашумевшей является технология CRISPR-Cas9. О ней мы скоро поговорим особенно подробно^9,10.

Две другие технологии геномного редактирования – это так называемые «цинковые пальцы» и TALEN. Попробуем разобраться в самых общих чертах, что все это из себя представляет.

Цинковые пальцы или сокращенно ZNF (Zinc-finger nucleases – с английского «нуклеазы цинкового пальца») – технология, которая состоит из двух компонентов. Первый – синтетические белки заданной формы с ионом цинка, которые могут связываться с определённым коротким участком ДНК. А второй – нуклеаза, то есть фермент, способный расщеплять в этом выбранном месте ДНК. Вместе они работают как «геномные ножницы», разделяя нуклеотидную последовательность^14,15.

TALEN (Transcription activator-like effector nuclease – с английского «эффекторная нуклеаза, подобная активатору транскрипции») работает по схожему принципу. TALE – специальный белок, полученный от растительных бактерий Xanthomonas. А буква «N» в этой аббревиатуре означает нуклеазу, тот самый разрезающий ДНК фермент.

И ZNF, и TALEN – методы, основанные на природных свойствах определенных нуклеаз. Эти ферменты умеют проводить специфическое вырезание участка генома и встраивание на место разреза фрагмента исправленной ДНК, привнесенного с собой. Такой способ позволяет проводить целевые и точечные изменения нарушенных генов, гораздо более точное, чем у предшествующих технологий.

Отличие ZFN и TALEN заключается в использовании разных видов ферментов, но сам общий итог их работы примерно одинаков.

К сожалению, ZFN и TALEN пока не нашли массового применения в медицине, прежде всего из-за значительной сложности этих методов. Для редактирования же генома с помощью системы CRISPR/Cas9 используется единственный белок Cas9. Технология основана на простом принципе комплементарного узнавания нуклеиновых кислот, а все необходимое можно создать за довольно короткое время. Это уровень редактирования, более дешевый и простой^14,15.

Так что же такое CRISPR-Cas9? Давайте разбираться!

Долгое время считалось, что бактерии не имеют, в отличие от животных и человека, своей собственной иммунной защиты. В нашем организме за иммунитет отвечает множество клеток, организованных в чрезвычайно сложную молекулярную структуру. Однако, как выяснилось, и у бактерий есть своя, но гораздо более простая система молекулярного иммунитета, обеспечивающая бактериальной клетке защиту от внешних врагов – фагов и других патогенов.

Еще в 1989 г. японские исследователи обнаружили в геноме кишечной палочки участок, содержащий многочисленные повторы. Его назвали CRISPR-локусом (с английского «clustered regularly interspaced short palindromic repeats» – короткие палиндромные повторы, регулярно расположенные группами). Что собственно и дало название будущей технологии.

Их структура была идентична по нуклеотидным последовательностям, а вот у промежутков, или, как их теперь называют, спейсеров (от английского «spacer» – разделитель, вставка), она оказалась вариабельной и часто была гомологичной последовательностям, обнаруженным в геномах фагов и плазмид. По сути, такой участок – это генетическая память популяции бактерий о тех столкновениях с внешним врагом, в борьбе с которым бактериальной клетке удалось выжить и «законспектировать» встречу.

Иными словами, в этих промежутках (спейсерах) закладывается впрок на хранение информация о бактериофагах (вирусы, поражающие бактерий), которая используется бактериями в уникальной системе защиты от губительного воздействия патогенов. В состав этого адаптивного молекулярного иммунитета входят палиндромные повторы, спейсеры и гены специализированных нуклеаз Cas – ферментов, способных вырезать участки нуклеиновых кислот. Примерно аналогичных технологиям, которые мы обсуждали выше¹⁰.

Возникает вопрос: почему же нуклеаза помечена именно цифрой 9? Вообще-то, их в бактериальной клетке больше десяти, но наиболее подходящей для функционирования CRISPR-системы оказалась именно Cas9.

В 2012 г. появились первые публикации, описавшие применение технологии CRISPR Cas9 для редактирования генома эукариотов, то есть животных и человека. А в научном языке для его обозначения стали использовать термин «CRISPR-система». С тех пор число статей по этой теме стало расти огромными темпами^9–12.

Как оказалось, компоненты CRISPR-системы можно адаптировать к другим геномам, к использованию на клетках человека, и там она будет работать по «навязанной» ей программе. При этом с высокой точностью отыщется любая нуклеотидная последовательность. Например, в геноме человека насчитывается более 3 миллиардов пар нуклеотидов, и на всей этой огромной протяженности возможно разрезать спираль ДНК в точном и конкретном месте, удалить или подправить «плохой», «сломанный» ген и вшить вместо него другой – «здоровый»^13,17.

Совсем недавно, в 2020 году, за разработку этого блестящего метода в применении к клеткам человека ученые Дженнифер Даудна и Эммануэль Шарпантье удостоены Нобелевской премии по химии. Сначала на бактерии Streptococcus pyogenes (синегнойная палочка) они установили, как именно работает белок Cas9, а позднее смогли показать, что с помощью такого механизма можно разрезать в заданной точке любую молекулу ДНК, в том числе и ДНК человека¹⁷.

Конечно же, создание системы CRISPR-Cas немедленно явилось мощным стимулом ее использования и в нашей стране. Внедрение новой технологии произвело настоящую революцию в области генетической терапии, поскольку она позволяет намного более точно редактировать гены, чем ранее описанные инструменты, проверить ее на животных моделях и вплотную подступить к лечению генетических заболеваний у людей.

Уже показано, что метод CRISPR невероятно полезен при моделировании наследственных болезней, и в первую редких для человеческой популяции. Модели заболеваний, в развитие которых вовлечены множество генов, созданные с помощью CRISPR-системы, дают возможность определить, нокаут (выключение) каких именно генов приводит к тем или иным изменениям в клетках, как из клеток формируются разнообразные ткани с различным генетическим фоном и какие молекулярные события происходят при развитии того или иного патологического процесса. Такие данные позволяют существенно улучшить наше понимание о природе тех или иных заболеваний и, изучив механизмы, лучше подбирать методы терапии.

Еще одна громадная задача, решаемая посредством CRISPR Cas9, – разработка методов лечения вирусных инфекций, например, вируса иммунодефицита человека ВИЧ, после которого клетки становятся невосприимчивыми к ВИЧ, а также коррекция мутаций, обусловливающих различные наследственные заболевания – муковисцидоз, миодистрофию Дюшена, гемофилию, серповидноклеточную анемию и множество других заболеваний^10,19,20.

Крупным прорывом в области генной терапии стало сообщение о том, что ученые-клиницисты сохранили жизнь девочке, родившейся с фатальным наследственным нейромышечным заболеванием – спинальной мышечной атрофией 1го типа. При этом страшном генетическом заболевании возникает нарастающая мышечная слабость и у пациента прогрессивно снижается способность мышц к сокращению. По мере прогрессирования болезни возникают непреодолимые нарушения дыхания и глотания – младенец задыхается и редко может пережить даже первый год. В 8 недель крохотная пациентка прошла курс генной терапии, в рамках которого отсутствующий ген ввели в ее спинальные нейроны. Результаты испытания явились одним из самых впечатляющих успехов в некогда проблемной области, поскольку исследователи впервые провели новый ген через гематоэнцефалический барьер (полупроницаемый барьер между кровью и нервной тканью, препятствующий проникновению в мозг крупных молекул, а также клеток крови)¹⁰. Девочка выжила и выздоровела!

Как мы помним, опухолевые заболевания также огромная проблема для людей по всему миру. Конечно, генная терапия и новые технологии являются серьезным и многообещающим подходом и к их лечению.

В онкологии легкость и универсальность CRISPR-Cas9 позволили обнаружить новые гены-мишени и раскрыть ряд механизмов приобретаемой устойчивости к противоопухолевой терапии. До сих пор большинство исследований проводилось на опухолях у взрослых. Но в последние годы технология CRISPR Cas9 стала применяться и в лечении редких детских злокачественных новообразований, например, сарком мягких тканей^17,21,22,23.

Источник: https://www.iberdrola.com/innovation/genetic-modification-crispr

Однако, несмотря на вдохновляющие успехи, система редактирования CRISPR-Cas9 в настоящий момент несовершенна, а в результате ее работы по ряду причин существует вероятность неправильного связывания и возникновения так называемых нецелевых эффектов. В этих неблагоприятных случаях могут появляться случайные разрезы ДНК и, следовательно, дополнительные ошибки и «сбои» в последовательности. Это небезопасно и непредсказуемо, ввиду чего внедрение таких технологий в медицинскую практику пока происходит очень осторожно и медленнее, чем ожидалось. В том числе и в нашей стране.

Как минимизировать эти риски и повысить вероятность гомологичной, то есть «правильной» рекомбинации – все это насущные задачи современности, которые пытаются решить во многих лабораториях по всему миру^10,16.

Множество зарубежных компаний, исследовательских институтов и стартапов активно занимаются развитием и выводом в коммерческий доступ новых технологий, которые могут сделать прорыв в медицине. А у нас, в России исследования в этой области идут, например, в инновационном центре Сколково, а также в институте химической биологии и фундаментальной медицины в Новосибирске.

Напечатайте мне ухо

Не менее увлекательным примером развития современных медицинских биотехнологий является область регенеративной медицины.

В целом, регенеративная медицина занимается разработкой решений по замене утраченных тканей и органов, или же по ускорению их заживления. Биотехнология использует стволовые клетки, превращая их в другие клетки со специализированной функцией – к примеру, нервные клетки, сердечные, клетки печени или крови.

Один из очень перспективных методов восстановления тканей – биопринтинг. Грубо говоря, печатание напрямую клетками!

Для того чтобы сделать эту фантастику возможной, стволовые клетки размещают на натуральном или синтетическом материале, а для создания объёмной ткани используют оборудование аналогичное таковому для 3D-печати. В напечатанной ткани, затем, используют ряд вспомогательных методов для образования сосудов и нервов, добавляя факторы роста и клетки-предшественники.

Трансплантация, то есть пересадка таких продуктов биопринтинга направлена на ускорение заживления при значительной потере ткани, как например в случае серьёзной травмы кости. Также в наше время проводится множество успешных исследований в области печати кожи, нервной ткани и клеток печени^24,25,26.

Первые попытки реализации 3D-печати человеческих «запчастей» предпринимались еще в 2000 году. Биоинженер Томас Боланд приспособил для этого принтеры от «Lexmark» и «HP», которые создавали фрагменты ДНК. Устройства специально были выбраны с достаточно крупным диаметром сопла – для сохранения целостности живых клеток при печати. А кроме того, потребовалось модернизировать софт, чтобы иметь возможность контролировать температуру и вязкость «чернил». Технологию запатентовали три года спустя, и с тех пор индустрия неуклонно развивалась, представляя все новые и новые варианты печати.

В 2022 году ученые впервые смогли пересадить человеку орган, напечатанный на 3D-принтере. У 20-летней мексиканки Алексы с редким врожденным дефектом – микротией – было деформировано правое ухо. Для создания имплантата врачи использовали клетки и ткани самой пациентки. Американская компания 3DBio Therapeutics удалила 0,5 грамма хряща деформированного уха, а затем 3D-принтер напечатал новое ухо с помощью клеток и так называемых биочернил. Весь процесс занял менее десяти минут!²⁷.

В России также пройдено много шагов на пути к освоению новой перспективной технологии. Конечно, можно себе представить печать костной ткани или, например, кожи. А как на счет полноценного органа, способного выполнять свою функцию?

И здесь нам есть чем гордиться!

Пример тому – профессор Владимир Миронов, биоинженер по созданию тканей, а также научный директор «3D Bioprinting Solutions» – российской лаборатории биотехнологических исследований, резидента Сколково. В его лаборатории занимаются разработками в сфере 3D-печати для применения в регенеративной медицине.

Нашим ученым удалось впервые в мире создать с помощью 3D-печати орган, пригодный для трансплантации лабораторной мыши. Напечатанную на 3D-принтере щитовидную железу удалось пересадить, она прижилась и более того – оказалась абсолютно функциональной!

Хотя исследователи решили начать с щитовидной железы, относительно простого органа, успех этой операции делает возможной 3D-печать почек и даже печени²⁸. Помимо успешной пересадки, напечатанной на 3D-принтере щитовидной железы, сейчас известно уже и о других новейших разработках.

Среди них, например, системы кровеносных сосудов, напечатанные китайской компанией Revotek, и первые шаги к 3D-печати сердца, которые делают ученые из Университета Карнеги-Меллон в Питтсбурге, где недавно удалось создать неживые копии коронарных артерий и сердец эмбрионов из мягких материалов при помощи специального 3D-принтера²⁸.

Площадка по производству биомедицинских клеточных продуктов в нашей стране уже есть. Еще в 2014 году ее открыла российская научно-производственная компания полного цикла «Генериум».

Сейчас это первый и пока единственный в России производитель, получивший лицензию на производство таких сложных биотехнологических продуктов. Компания активно исследует продукт, выращенный из аутологичных хондроцитов (клеток хрящевой ткани) человека. Также в планах «Генериум» разработка аллогенного клеточного продукта на основе мезенхимальных стволовых клеток (клетки способные трансформироваться в разные типы других зрелых клеток).

Свое применение этот биопрепарат сможет найти, например, у больных гонартрозом и синдромом диабетической стопы, ну а пока его исследуют на животных²⁹.

Нанобиотехнологии – видно без микроскопа?

Последним примером, но далеко не последним существующим, приведу нанобиотехнологии.

Совмещая в себе две и по отдельности головокружительно сложных области науки они, конечно, тоже имеют множество интересных примеров разработок и использования.

В целом, что очевидно, нанобиотехнологии работают на молекулярном и клеточном уровнях. За счет своего крохотного размера и связанных с ним преимуществ у наночастиц сейчас отмечается огромный потенциал в таких областях как, например, терапия онкологических заболеваний.

Связано это с тем, что наночастицы способны обеспечить точную доставку и распределение лекарств в опухолевом участке. Для этого на их поверхность добавляют специальные молекулы или моноклональные антитела, чтобы улучшить распознавание опухоли и доставить лекарство «по адресу».

Созвучно таргетной терапии, которую мы уже обсуждали, не так ли?

Например, подобных успехов удалось совсем недавно, в 2021 году, достичь в Санкт-Петербурге. Ученые Санкт-Петербургского государственного электротехнического университета «ЛЭТИ», совместно с коллегами из ФГБУ «НМИЦ им. В. А. Алмазова» предложили новый принцип использования магнитных наночастиц в таргетной доставке лекарств. Полученные результаты будут положены в основу разработки магнитно-контролируемого транспорта цитостатических препаратов прямо в опухолевую ткань^32,33.

Похожие разработки ведутся и в Санкт-Петербургском политехническом университете Петра Великого, вместе с Российским научным центром радиологии и хирургических технологий имени академика А. М. Гранова. Там наши ученые работают над созданием платформенной технологии для создания радиофармпрепаратов.

Этот конструктор подразумевает доставку радиоактивного изотопа, обладающего терапевтическим эффектом, в саму раковую опухоль, а в качестве системы доставки используются как раз наночастицы. Как и в случае с цитостатиком, такой подход позволит эффективно воздействовать на опухоль и не подвергать облучению (или интоксикации, в случае цитостатика) весь организм.

Разработанная платформа также позволит собрать нужный фармпрепарат под конкретную задачу – как для терапевтических, так и для диагностических задач. Ее можно будет использовать не только для лечения онкологических патологий, но и, например, для терапии синовита (воспаления сустава)^32,33.

Активный интерес в качестве терапии привлекают и более простые, физические методы нанотерпии – например, гипертермия. Есть данные, что опухолевые клетки намного более чувствительны к нагреву, чем здоровые. Грубо говоря, их можно убить достигнутой локально температурой в 41–43° градус по Цельсию. Доставленные с этой целью в опухоль наночастицы могут облучаться микроволнами, нагреваться, попутно «разогревая» перерожденные клетки и уничтожать опухоль изнутри – как своего рода «бомбы»³⁴.

Ведутся активные разработки и в области создания нанороботов, которые смогут не только заниматься диагностикой заболевания, но и восстанавливать неисправности клеток на молекулярном уровне, справляясь с опухолью на уровне генома клеток.

Но онкология, конечно, далеко не единственная область для применения нанобиотехнологий.

Также эти методы используются и для тканевой инженерии в регенеративной медицине. Биологические материалы, включающие наночастицы, нанотрубки и различные нановолокна могут служить идеальной средой для роста и развития на их матрице клеток. Ну а это уже тема, которую мы совсем недавно обсуждали.

Отличный синтез между инновационными разработками!

С помощью нанобиотехнологий также получается добиться и противомикробной, антибактериальной активности. Обладая крохотными размерами наноматериалы, например, с ионами серебра, могут подавлять жизнедеятельность бактерий, включая и штаммы устойчивые к традиционной антибиотикотерапии^26,30,31.

Область медицинских биотехнологий развивается невероятно стремительно и буквально каждый день появляются сотни новых статей об успешных опытах и новых прорывных идеях. Большинство из них еще находятся на этапе апробации и исследований, но все чаще добираются и до рутинной клинической практики.

Российская наука идет в ногу со временем, осваивает современные технологии и в синергии с материально-техническим фундаментом фармацевтических и биотехнологических компаний сможет создавать продукты будущего для улучшения жизни и здоровьях наших граждан уже в самые ближайшие дни.