Сергей Бабичев
Медицинская микробиология, иммунология и вирусология

Полная версия

L-трансформация бактерий

Впервые эта форма изменчивости бактерий была описана в 1935 г. Е. Клинебергер. Она обнаружила и выделила из культуры Streptobacillus moniliformis необычные варианты, которые росли в виде маленьких характерных колоний с врастающей в агар центральной и фестончатой полупрозрачной периферической зонами. В этих колониях обнаруживались самые разнообразные по морфологии структуры: нитевидные, волокнистые, колбасовидные, шаровидные образования и мелкие гранулы размером 0,1 – 0,15 мкм (фильтрующиеся формы бактерий). Поскольку этот феномен был обнаружен в институте имени Листера, то таким необычным вариантам бактерий дали название L-форм, а такую изменчивость бактерий назвали L-трансформацией. Она может быть обратимой и необратимой. В случае если генетический контроль синтеза клеточной стенки сохраняется, L-формы при благоприятных условиях могут возвращаться в исходную бактериальную форму с восстановлением всех основных биологических свойств, включая патогенность. Если же генетический контроль синтеза клеточной стенки нарушен необратимо, L-трансформация приобретает необратимый характер, а такие L-трансформанты по своим морфологическим, культуральным и иным свойствам становятся неотличимыми от микоплазм. L-трансформации могут подвергаться, по-видимому, все бактерии, имеющие клеточную стенку, а все образующиеся L-формы, независимо от вида бактерий, из которого они возникли, обладают следующими общими для них особенностями:

1. Сходство морфологических изменений: образование нитевидных, волокнистых, колбасовидных, шаровидных и гранулярных форм.

2. Сходные культуральные свойства: анаэробные или микроаэрофильные условия роста, потребность в холестерине и сывороточном белке, рост на плотных средах в виде характерных колоний двух типов – А и В (рис. 8). Колонии типа А растут на поверхности агара, имеют очень мелкие размеры. Они состоят главным образом из гранулярных структур, лишенных клеточной стенки, и очень похожи на микоплазмы. Колонии типа В состоят из центральной зоны, врастающей в агар, и прозрачной фестончатой периферической зоны. Они похожи по внешнему виду на колонии типа «глазуньи», образуемые микоплазмами, но более крупные и грубые. В этих колониях обнаруживаются крупные тела, содержащие компоненты клеточной стенки, сходные со стенкой родительских бактерий, но лишенные ригидности. Многие бактерии образуют колонии А и В типов, однако грамположительные бактерии (Streptococcus, Staphylococcus) чаще образуют колонии только типа А. L-формы бактерий из колоний типа В легко ревертируют в исходные формы. Колонии типа А более стабильны и ревертируют в исходные формы значительно реже.

3. Постепенное (по мере нарушения синтеза клеточной стенки) превращение из грамположительных в грамотрицательные структуры.

4. Образование стабильных и нестабильных L-форм (в зависимости от степени полноты утраты способности синтезировать клеточную стенку).

5. Изменение антигенных свойств (утрата К- и О-антигенов как следствие нарушения синтеза клеточной стенки).

Рис. 8. L-формы бактерий:

1 – колонии L-форм типа 3А и 3В; 2 – пузыревидные, грушевидные и субмикроскопические элементы L-форм дифтерийной палочки

6. Снижение вирулентности по сравнению с исходными родительскими формами в связи с утратой различных факторов патогенности (адгезии, инвазии, эндотоксина и т. п.).

7. Способность длительно персистировать (переживать) в организме. Утрата клеточной стенки делает L-формы нечувствительными к различным химиопрепаратам и антителам.

8. Способность при неполной утрате синтеза клеточной стенки возвращаться в исходную бактериальную форму.

L-трансформация происходит как in vitro, так и in vivo (в организме человека и животных). Факторами, индуцирующими ее, являются различные антибиотики, угнетающие биосинтез клеточной стенки (пенициллин, цефалоспорины, циклосерин, ванкомицин и т. п.); ферменты (лизоцим, амидаза, эндопептидаза); антимикробные антитела; высокие концентрации некоторых аминокислот, особенно глицина и фенилаланина.

Исключительное значение L-трансформации патогенных бактерий заключается в том, что она является частой причиной перехода острых форм заболеваний в хронические и их обострений. L-трансформацию надо рассматривать не просто как одно из проявлений изменчивости бактерий, а как своеобразную, присущую всем бактериям форму приспособления к неблагоприятным условиям существования (подобно спорообразованию), которая способствует сохранению вида бактерий в природе. Клеточная стенка и ее синтез чувствительны к действию антител и различных химиопрепаратов. Освобождение от нее не лишает бактерии жизнеспособности, но позволяет переживать действие этих неблагоприятных для них факторов, а по их устранении – возвращаться в свое исходное состояние.

Принимая во внимание особую роль клеточной стенки в жизни бактерий, ей можно дать такое определение. Клеточная стенка – сложный структурный элемент, встречающийся только у эубактерий (кроме микоплазм) и характеризующийся наличием в его составе уникального химического соединения – пептидогликана, наделяющего клетку важными иммунобиологическими свойствами и определяющего ее постоянную форму; нарушение его синтеза приводит к превращению бактерий в L-формы, с помощью которых и обеспечивается, главным образом, длительное персистирование возбудителя в организме – одна из основных причин перехода заболевания из острой в хроническую форму. Соответственно L-трансформация, как и спорообразование, является важнейшей формой приспособления бактерий к неблагоприятным условиям существования.

Цитоплазматическая мембрана бактерий

Цитоплазматическая мембрана (ЦМ) является исключительно полифункциональной структурой.

1. ЦМ воспринимает всю химическую информацию, поступающую в клетку из внешней среды.

2. Она является основным осмотическим барьером, благодаря которому внутри клетки поддерживается определенное осмотическое давление.

3. ЦМ совместно с клеточной стенкой участвует в регуляции роста и клеточного деления бактерий.

4. ЦМ участвует в регуляции процессов репликации и сегрегации хромосом и плазмид (они связаны с ее рецепторами).

5. В ЦМ содержится значительное количество ферментов, в том числе системы переноса электронов (ЦМ – место генерации энергии у бактерий).

6. С ЦМ связаны жгутики и аппарат регуляции их движения.

7. ЦМ участвует в процессах транспорта (в том числе активного) питательных веществ в клетку и продуктов жизнедеятельности, включая ферменты и экзотоксины, из клетки в окружающую среду. В ней содержатся белки, участвующие в облегченной диффузии и активном транспорте.

8. ЦМ участвует в синтезе компонентов клеточной стенки и образовании мезосом (мезосомы возникают в результате инвагинации участка ЦМ в цитоплазму, они открыты в периплазматическое пространство).

9. ЦМ играет важную роль в компартментализации (англ. compartment – отсек, отделение), т. е. в разделении на «отсеки» рибосом и их стабилизации.

Каким образом мембрана осуществляет на молекулярном уровне свои многочисленные функции – один из актуальнейших вопросов современной биологии. На долю ЦМ приходится около 10 % сухого веса бактерий. Она содержит 25 – 40 % фосфолипидов, образующих два слоя, 20 – 75 % белков и до 6 % углеводов. Молекулы фосфолипидов асимметричны: головки, несущие электрический заряд, гидрофильны; хвостики – нейтральны и гидрофобны. Фосфолипиды упакованы в мембране следующим образом: их полярные гидрофильные головки обращены наружу и образуют два слоя ЦМ – внутренний и внешний, а неполярные гидрофобные хвостики скрыты в толще мембраны. На электронограммах ЦМ имеет вид трехслойной структуры, состоящей из двух параллельных темных слоев и разделяющего их светлого слоя. Этот слой более проницаем для электронов, чем слои, состоящие из полярных концов фосфолипидов, ассоциированных с белками. Специфичность функций ЦМ во многом зависит от набора содержащихся в них белков. Расположение их в ЦМ своеобразно (рис. 9): некоторые белки пронизывают весь двойной липидный слой, определенная часть белков связана или только с внутренней, или только с наружной поверхностью мембраны. Это вытекает из того, что взаимодействие между мембраной и цитоплазмой, с одной стороны, мембраной и внешней средой – с другой, определяет различные, хотя и взаимосвязанные, процессы ее жизнеобеспечения: облегченная диффузия, активный транспорт, перенос электронов, мобилизация энергии и т. п. Молекулы белков и других соединений, входящих в состав ЦМ, обладают значительной свободой перемещения.

Рис. 9. Схематическая модель элементарной биологической мембраны

Структура, состоящая из клеточной стенки и ЦМ, получила название оболочки клетки.

Цитоплазма

Цитоплазма бактерий представляет собой сложную коллоидную систему, в ней нет эндоплазматического ретикулума и других цитоплазматических органелл, свойственных эукариотам; она неподвижна. Правда, в цитоплазме Mycobacterium, Streptococcus, Clostridium, Proteus обнаружены микротрубочки – рапидосомы, сходные с микротрубочками простейших. У некоторых прокариот имеются три типа органелл, окруженных белковыми мембранами: газовые пузырьки (у водных прокариот, например, пурпурных и серных бактерий, галобактерий и др.), хлоробиум-везикулы (в них у фотосинтезирующих бактерий размещается аппарат фотосинтеза) и карбоксисомы (в них содержится большая часть основного фермента процесса фиксации CO₂ – карбоксидисмутазы). В цитоплазме располагается ядерный аппарат – генофор (нуклеоплазма), который не отделен от нее никакими мембранами. Кроме хромосомы (хромосом), в цитоплазме многих бактерий, в том числе патогенных, имеются плазмиды, иногда целый их комплекс. Как хромосома, так и плазмиды связаны со специфическими рецепторами на ЦМ. В цитоплазме располагаются бактериальные рибосомы 70S и все остальные компоненты белоксинтезирующей системы. Помимо этих основных структурных элементов, являющихся главными атрибутами живой клетки, в цитоплазме содержатся различные макромолекулы (тРНК, аминокислоты, нуклеотиды и т. п.); могут быть мезосомы, которые участвуют в энергетическом обмене, формировании межклеточной перегородки при делении, спорообразовании и, возможно, обладают другими функциями. Нередко в цитоплазме бактерий обнаруживаются различные включения, которые образуются в процессе жизнедеятельности: капельки нейтральных липидов; воска, серы, гранулезы (специфическое запасное углеводное вещество, накапливающееся у бактерий рода Clostridium); гранулы гликогена; волютина (метаполифосфата), особенно у Spirillum volutans и Corynebacterium diphtheriae – возбудителя дифтерии; поли-β-гидроксимасляной кислоты – ПОМ (особенно у рода Bacillus). Гранулеза, гликоген, ПОМ, зерна волютина служат для бактерий запасным источником энергии. У некоторых бактерий (Bacillus thuringiensis) в цитоплазме находятся кристаллы белковой природы, обладающие ядовитым действием для насекомых. У разных биологических групп бактерий могут быть и другие внутрицитоплазматические включения метаболического происхождения.

Периплазматическое пространство

Между ЦМ и внутренним слоем пептидогликана находится периплазматическое пространство, ширина его у грамположительных бактерий составляет около 10 нм. При электронной микроскопии обнаружено, что у грамположительных и, вероятно, у грамотрицательных бактерий между внутренней поверхностью пептидогликана и наружной поверхностью ЦМ имеются регулярно повторяющиеся перемычки. Поры, содержащиеся в клеточной стенке, открываются в периплазматическое пространство. В него всегда открыты и мезосомы. Периплазматическое пространство играет существенную роль во взаимодействии ЦМ и клеточной стенки, в нем содержатся различные ферменты, по преимуществу фосфатазы, связывающие белки, олигосахариды и другие вещества.

Капсулы

У бактерий различают микрокапсулу, капсулу и слизистый слой. Микрокапсула выявляется при электронной микроскопии в виде коротких мукополисахаридных фибрилл. Ее роль и значение не совсем ясны. Капсула представляет собой слизистый слой, который обычно сохраняет связь с клеточной стенкой. Капсула служит внешним покровом бактерий, толщина ее более 0,2 мкм, она четко обнаруживается под микроскопом после негативного окрашивания, например по способу Бурри – Гинса (см. цв. вкл., рис. 10). Капсулы, в связи с их гелеобразной консистенцией, плохо удерживают красители, поэтому для их обнаружения наиболее приемлем метод негативного контрастирования. Макромолекулы капсулы сильно гидратированы, расположены рыхло и не препятствуют поступлению веществ в клетку и выходу продуктов ее метаболизма наружу. В образовании капсулы принимает участие ЦМ. По химическому составу различают капсулы, состоящие из полисахаридов, не содержащих азота; полисахаридов, содержащих азот (аминосахара); капсулы полипептидной природы (табл. 3). Капсулу полипептидной природы образуют несколько видов Bacillus, она у них состоит из D-глутаминовой кислоты, и Y. pestis.

Таблица 3

Химический состав капсул некоторых бактерий

Некоторые виды патогенных бактерий (S. pneumoniae, B. anthracis, C. perfringens и др.) образуют капсулы лишь в организме человека или животного, другие – как в организме, так и на искусственных питательных (иногда специальных) средах (S. aureus, S. pyogenes, Klebsiella pneumoniae, K. rhinoscleromatis и др.). У патогенных бактерий капсула может окружать одну (Y. pestis), две (S. pneumoniae) или целую цепочку (B. anthracis, K. pneumoniae) клеток. Некоторые сапрофитные бактерии (Leuconostoc mesenteroides, Zoogloea) образуют зооглеи – скопления клеток, заключенные в одну общую капсулу. Хотя капсулы не являются для бактерий жизненно необходимыми, они наделяют их многими важными свойствами. Совместно с клеточной стенкой и ЦМ они образуют более мощную оболочку бактерий, предохраняют их от высыхания, несут для них запасные питательные вещества. Капсульные антигены патогенных бактерий определяют их антигенную специфичность и иммуногенные свойства. Например, наиболее эффективные вакцины против менингококковых и пневмококковых заболеваний готовят из капсульных полисахаридов возбудителей. У многих бактерий капсулы являются важными факторами патогенности: они либо маскируют их от фагоцитов, либо подавляют фагоцитоз. Утрата способности синтезировать капсулу у пневмококков, например, сопровождается полной утратой патогенности.

Слизистые слои. Нередко слизистые экзополимеры выделяются бактериальной клеткой в значительно большем количестве, частично отделяются от нее и образуют рыхлый слизистый слой.

Жгутики

По механизму движения бактерии подразделяют на плавающие и скользящие, или ползающие. Последние активно передвигаются по плотной поверхности благодаря волнообразным сокращениям тела (некоторые виды Mycoplasma, Myxococcus и др.). У плавающих бактерий органом движения являются жгутики, которые представляют собой тонкие длинные нитевидные белковые образования диаметром 12 – 30 нм и длиной от 6 – 9 до 80 мкм. Белок, из которого построены жгутики, получил название флагеллина. Он отличается от других белков, содержащихся в бактериальной клетке. Флагеллин обладает сократительной способностью, хотя механизм ее не совсем понятен.

Жгутик состоит из однотипных спиралевидно или продольно уложенных вокруг полой сердцевины белковых субъединиц, образующих цилиндрическую структуру, которая особым образом прикреплена к бактериальной клетке. По характеру расположения жгутиков и их количеству подвижные бактерии условно делят на четыре группы (рис. 11):

1) монотрихи – один полярно расположенный жгутик (Vibrio cholerae);

2) лофотрихи – пучок жгутиков на одном конце (Pseudomonas methanica);

3) амфитрихи – пучки жгутиков на обоих концах клетки (Spirillum volutans);

4) перитрихи – множество жгутиков, расположенных вокруг клетки (E. coli, Salmonella typhi).

Жгутик состоит из трех компонентов – спиральной жгутиковой нити постоянной толщины, крючка и базального тельца (рис. 12). Крючок, к которому присоединена жгутиковая нить, имеет длину 30 – 45 нм и состоит из отличающегося от флагеллина белка. Он соединен с базальным тельцем, которое располагается целиком в оболочке (в клеточной стенке и ЦМ).

Рис. 11. Расположение жгутиков у бактерий:

1 – монотрихи; 2 – лофотрихи; 3, 4 – амфитрихи; 5 – перитрихи

Рис. 12. Схематическая модель бактериального жгутика

Базальное тельце состоит из центрального стержня, заключенного в систему особых колец. У грамотрицательных бактерий их две пары: внешняя (кольца L и P) и внутренняя (кольца S и М). Кольца L и P расположены внутри клеточной стенки (кольцо L – в ЛПС, а кольцо P – в слое пептидогликана). Они выполняют, очевидно, роль втулки для стержня. Внутренняя пара (кольца S и M) фиксирована на ЦМ, причем кольцо S располагается в периплазматическом пространстве, а кольцо М – на ЦМ или в ней.

Жгутики у грамположительных бактерий, имеющих более толстую и гомогенную клеточную стенку, содержат только одну пару колец – S и M. Вращение жгутиков в клеточной стенке происходит из-за вращательного движения колец S и M относительно друг друга и обеспечивается за счет энергии трансмембранного градиента ионов водорода или натрия. Благодаря такому вращению происходит движение бактерий в наиболее благоприятном для них направлении. Жгутиковый аппарат обладает особым бинарным переключателем, который позволяет менять направление вращения жгутиков против часовой стрелки на противоположное. Таким способом бактерии, получив химический сигнал из окружающей среды, изменяют направление движения и выбирают оптимальные условия обитания. По всей вероятности, базальное тельце (его внутреннее кольцо М) непосредственно связано с какими-то дополнительными жгутиковыми белками, которые необходимы для сборки жгутиков и управления переключением направления их вращения и которые расположены либо в ЦМ, либо сразу под ней. Со жгутиковым аппаратом связана также и хемотаксическая активность таких бактерий. Генетический контроль синтеза жгутиковых белков, их сборки и активности осуществляется особым опероном. Установлено, что мутации в области mot-генов (англ. motility – подвижность) приводят к потере только подвижности, однако все структуры жгутиков сохраняются; мутации в cheгенах (англ. chemotaxis – хемо + подвижность) – к потере хемотаксической активности при сохранении структуры жгутиков и их подвижности. Подвижность бактерий определяют либо микроскопически (с помощью фазово-контрастной или обычной световой микроскопии «раздавленной» или «висячей» капли соответственно), либо бактериологически (при посеве уколом в столбик полужидкого агара: подвижные бактерии дают диффузный рост, а неподвижные – растут только по ходу укола). Жгутики хорошо выявляются при электронной микроскопии (рис. 13). Жгутиковые бактерии могут двигаться с большой скоростью, например Bacillus megaterium движется со скоростью 27 мкм/с, а Vibrio cholerae – 200 мкм/с.

Донорные ворсинки. У бактерий, являющихся носителями конъюгативных плазмид (F-плазмид, R-плазмид и др.), имеются длинные (0,5 – 10 мкм) нитевидные структуры белковой природы, получившие название донорных ворсинок, или донорных пилей (англ. pile – волосок). Как и жгутики, они имеют внутреннюю полость и построены из особого белка. Их синтез находится под контролем плазмидных генов. Они служат аппаратом конъюгации – с их помощью устанавливается непосредственный контакт между донорной и реципиентной клетками. Донорные пили обнаруживают с помощью донорспецифических фагов, которые на них адсорбируются и далее вызывают лизис клетки-хозяина. Донорные пили встречаются в количестве 1 – 2 на клетку.

Фимбрии, или реснички. Фимбрии (англ. fimbria – бахрома) – короткие нити, в большом количестве (до многих тысяч) окружающие бактериальную клетку (рис. 14). Подобно жгутикам и донорным ворсинкам, они прикреплены к клеточной стенке, но значительно короче и тоньше – их длина 0,1 – 12,0 мкм, диаметр 25 нм. Белок фимбрий отличается от белков жгутиков и донорных ворсинок. Биологическое значение фимбрий, по-видимому, состоит в том, что с их помощью бактерии прикрепляются к определенным поверхностям. Для многих патогенных бактерий фимбрии являются важными факторами патогенности, так как с их помощью бактерии прикрепляются к чувствительным клеткам и заселяют их, т. е. фимбрии служат для бактерий факторами адгезии и колонизации.

Рис. 13. Жгутики бактерий (электронограмма Proteus vulgaris)

Рис. 14. Реснички (фимбрии) бактерий (электронограмма Bordetella parapertussis)