Коллектив авторов
Анализы. Актуальные сведения по лабораторным исследованиям под рукой
Сыворотка должна быть негемолизированной.
Необходимые реактивы
1. Ледяная уксусная кислота.
2. Концентрированная серная кислота.
3. Уксусный ангидрид.
4. Абсолютный этиловый спирт.
5. Кислотная смесь: в сухую колбу наливают 10 мл ледяной уксусной кислоты и 50 мл уксусного ангидрида, затем при постоянном перемешивании и охлаждении добавляют 10 мл концентрированной серной кислоты. Смесь должна быть бесцветной или слегка желтоватой. Хранить в холодильнике в темной склянке с притертой пробкой.
6. Калибровочный раствор: 232 мг холестерина растворяют в 2–3 мл хлороформа и доводят до объема 100 мл абсолютным этиловым спиртом. Приготовленный раствор содержит холестерин в концентрации 6 ммоль/л.
Ход определения
К 2,1 мл кислотной смеси медленно по стенке пробирки добавляют 0,1 мл плазмы или сыворотки без признаков гемолиза, перемешивают встряхиванием и ставят на 20 мин в термостат или на водяную баню при температуре 37 °C, затем фотометрируют в кювете с длиной оптического пути 0,5 см против реактива при длине волны 625 нм.
Построение калибровочной кривой и Расчет: к 0,05–0,2 мл калибровочного раствора добавляют такое количество кислотной смеси, чтобы общий объем был 2,2 мл, перемешивают и выдерживают 20 мин при температуре 37 °C, так же как и опытные пробы, а затем фотометрируют. Окраска калибровочной пробы, в которую взято 0,05 мл калибровочного раствора, соответствует содержанию холестерина в плазме 3 ммоль/л; пробы, в которую взято 0,1 мл, – содержанию 6 ммоль/л и т. д.
Примечания
1. Попадание воды приводит к помутнению раствора.
2. Следы гемолиза или желтушность исследуемой плазмы или сыворотки служат причинами завышенных результатов.
3. Можно использовать для фотометрии и кюветы с длиной оптического пути 1 см, тогда количество кислотной смеси удваивают, а количество исследуемого материала остается прежним.
Метод определения содержания холестерина в сыворотке крови, основанный на холестеролоксидазной реакции
Принцип метода
Холестерин и его эфиры выделяются из липопротеинов детергентами. Холестеринэстераза гидролизует эфиры. В результате последующего ферментативного окисления холестерина холестериноксидазой образуется Н2О2.
Эфир холестерина + Н2О2 ↔ холестерин + жирные кислоты;
холестерин + О2 ↔ холестен-3-ОН + Н2О2;
Н2О2 + n-хлорфенол + 4-аминоантипирин ↔
↔ хинониминовый краситель + Н2О2.
Уровни нормы ХС, выявленные при обследовании «в целом здорового населения», относительно высоки. С точки зрения риска развития ишемической болезни сердца уровни ХС желательны:
1) рекомендуемый – менее 5,18 ммоль/л;
2) умеренный риск – 5,18–6,19 ммоль/л;
3) высокий риск – более 6,22 ммоль/л.
Клинико-диагностическое значение
Увеличение концентрации ХС наблюдается при полигенной гиперлипопротеидемии типа II А и II Б, III, гиперлипопротеидемии I, IV, V типов, вторичной, приобретенной гиперлипопротеидемии, отмечается также при заболеваниях печени, внутри- и внепеченочном холестазе, гломерулонефрите, нефротическом синдроме, ХПН, злокачественных опухолях поджелудочной железы, простаты, гипотиреозе, подагре, ИБС, беременности, диабете, алкоголизме, анальбуминемии, дисглобулинемии, острой перемежающейся порфирии.
Снижение концентрации холестерина обнаружено при дефиците α-липопротеида (болезнь Танжера), гипо- и α-β-липопротеидемии, некрозе печеночных клеток, злокачественных опухолях печени, гипертиреозе, нарушении всасывания, нарушении питания, мегалобластной анемии, сидеробластной анемии, талассемии, острых тяжелых заболеваниях, обширных ожогах, хронических обструктивных заболеваниях легких, умственной отсталости, ревматоидном артрите, лимфангиоэктазии кишечника. Отмечены сезонные колебания уровня ХС: более высокие осенью и зимой, более низкие весной и летом. Повторное определение ХС после инфаркта миокарда необходимо проводить через 3 месяца.
Метод определения содержания липопротеинов высокой плотности в сыворотке крови
Липопротеины очень низкой плотности (ЛПОНП) и низкой плотности (ЛПНП) в противоположность липопротеинам высокой плотности (ЛПВП) образуют нерастворимые комплексы с гепарином в присутствии ионов марганца. В надосадочной жидкости, оставшейся после осаждения ЛПНП и ЛПОНП, остается α-холестерин или ЛПВП.
Нормальное содержание ХС ЛПВП в сыворотке крови составляет 0,9–1,9 ммоль/л.
Рекомендуются следующие показатели оценки вероятности развития атеросклероза (табл. 12).
Таблица 12
Оценка вероятности развития атеросклероза
Принцип метода
Хиломикроны, ЛПОНП (липопротеины очень низкой плотности) и ЛПНП (липопротеины низкой плотности) осаждаются добавлением фосфорно-вольфрамовой кислоты и хлорида магния.
После центрифугирования супернатант содержит ЛПВП (липопротеины высокой плотности) – фракцию, содержание холестерина в которой определяется ферментативно.
Полученные значения достоверны, если:
1) в пробе нет хиломикронов;
2) концентрация триацилглицеридов не превышает 400 мг/ 100 мл;
3) в пробах не обнаруживается следов III типа дислипопротеинемии.
Таблица 13
Зависимость нарушения липидного обмена от клинической интерпретации
При измерении на Hg 546 нм происходит завышение количества ЛПВП холестерина спектром поглощения гемоглобина, которое можно игнорировать при значениях до 200 мг Нb/100 мл.
Полученный при центрифугировании супернатант должен быть прозрачен. Если проба содержит большое количество триглицеридов (более 1000 мг/100 мл), осаждение липопротеинов может быть неполным (мутный супернатант) или часть осадка может плавать на поверхности. В этих случаях следует развести образец 1: 1 0,9 %-ным раствором NaCl и повторить осаждение.
Клинико-диагностическое значение ХС-ЛПВП
Эпидемиологические исследования показали обратную зависимость между уровнями ХС-ЛПВП и распространенностью ИБС. Определение ХС-ЛПВП способствует выявлению риска развития ИБС. Зависимость нарушения липидного обмена от клинической интерпретации представлена в таблице 14.
Повышению уровня ХС-ЛПВП способствуют такие заболевания, как первичный билиарный цирроз, хронический гепатит, алкоголизм, прочие хронические интоксикации.
Увеличение общих липидов наблюдается через 4 ч после приема пищи.
Основными заболеваниями, сопровождающимися возрастанием общих липидов, являются: ожирение, атеросклероз, сахарный диабет, злоупотребление алкоголем и др.
При ишемической болезни сердца, заболеваниях печени, поражении почек, гипотиреозе, алкоголизме регистрируется повышение общего холестерина.
Уменьшение содержания общего холестерина регистрируется при голодании, злокачественных новообразованиях, заболеваниях органов дыхания, повышенной функции щитовидной железы, анемии, лихорадочных состояниях, обширных ожогах, гнойно-септических заболеваниях и др.
Методы исследования углеводного обмена
Уровень глюкозы в крови, плазме (сыворотке) – лабильный показатель. Он отражает ее содержание в крови только в течение 15 мин. Повторное определение (после 15 мин) может показать другой уровень из-за быстрого изменения ее концентрации. Содержание глюкозы в моче характеризует ее уровень за 4–6 ч, в суточной моче – за 24 ч.
При исследовании глюкозы крови необходимо иметь в виду, что пациент должен перед исследованием голодать не менее 6–8 ч, быть в спокойном состоянии, перед анализом не должен курить, выполнять физическую работу.
Хранение пробы в холодильнике, длительное стояние пробы приводят к заниженным результатам. Несмотря на высокую точность глюкозооксидазного метода определения глюкозы, красители, используемые для измерения продукции перекиси водорода, могут подвергаться окислению и приводить к завышенным результатам.
Определение глюкозы в крови, плазме (сыворотке) и спинномозговой жидкости глюкозооксидазным методом
Принцип метода
Глюкоза в присутствии фермента глюкозооксидазы окисляется кислородом воздуха с образованием в ходе реакции перекиси водорода. Перекись водорода в присутствии фермента пероксидазы окисляет ортотолидин с образованием окрашенного соединения, интенсивность окраски которого пропорциональна содержанию глюкозы.
Нормальное содержание глюкозы – 4,1–5,9 ммоль/л; в возрасте от 60 до 90 лет – 4,6–6,4 ммоль/л; у детей – 3,3–5,6 ммоль/л.
Необходимые реактивы
1. Натрия хлорид, 9 г/л (изотонический раствор): готовят, растворяя 0,9 г NaCl в 100 мл воды.
2. Цинка сульфат, 50 г/л: 5 г сульфата цинка (ZnSО4) растворяют в воде, объем доводят до 100 мл.
3. Натр едкий, 0,3 моль/л: готовят, растворяя 1,2 г NaOH в 100 мл воды, концентрацию проверяют титрованием (она должна быть 0,3 н).
4. Ортотолуидин, 1 %-ный раствор: 1 г препарата растворяют в 100 мл абсолютного спирта. Раствор можно хранить в холодильнике в склянке с притертой пробкой несколько месяцев. Имеющийся в продаже препарат можно очистить перекристаллизацией, для чего его растворяют в абсолютном спирте, добавляют воду и выпавшие кристаллы отсасывают на фильтре, затем сушат над хлоридом кальция.
5. Ацетатный буферный раствор рН 4,8: смешивают 4 части 0,25 н уксусной кислоты (проверить титрованием) и 6 частей 0,25 н ацетата натрия (содержит 34 г CH3COONa × 3Н2О в 1 л).
6. Глюкозооксидаза – сухой препарат активностью 3000 ед/мг или больше.
7. Пероксидаза из хрена. Желательно использовать кристаллический препарат фирмы «Реанал» (Венгрия): 1 мг растворяют в 5 мл ацетатного буфера, в холодильнике можно хранить несколько дней.
8. Рабочий реактив: в 80 мл ацетатного буфера растворяют 2 мг глюкозооксидазы и 1 мг пероксидазы, прибавляют 1 мл 1%-ного раствора ортотолуидина, перемешивают и доводят объем буферным раствором до 100 мл. Рабочий реактив должен быть прозрачным, бесцветным или иметь слабо-зеленый оттенок, в этом случае он устойчив при хранении на холоде. Если же окраска интенсивна или через несколько часов после приготовления начинает выпадать осадок, это значит, что ортотолуидин недостаточно чистый и его надо перекристаллизовать.
9. Калибровочные растворы глюкозы. Глюкозу предварительно высушивают при температуре 37 °C и хранят в эксикаторе. Сначала готовят основной раствор с концентрацией 50 ммоль/л, для чего 180 мг вещества растворяют в 20 мл насыщенного раствора (примерно 0,3 %-ного) бензойной кислоты. Из этого раствора готовят рабочие калибровочные растворы, содержащие 3; 6; 9; 12; 15; 18 и 21 ммоль/л, для чего берут 0,6; 1,2; 1,8; 2,4; 3; 3,6 и 4,2 мл основного раствора и доводят насыщенным раствором бензойной кислоты до объема 10 мл. Эти растворы содержат глюкозу в тех же концентрациях, в которых она бывает в крови, что облегчает Расчеты при калибровке.
Ход определения
В центрифужные пробирки вносят 1,1 мл раствора хлорида натрия, 0,4 мл раствора сульфата цинка и 0,4 мл 0,3 н раствора NaOH, перемешивают; при этом образуется очень тонкий гель гидрата окиси цинка, в него выпускают 0,1 мл крови или калибровочного раствора, снова перемешивают и через 10 мин центрифугируют при скорости 3000 об./мин в течение 10 мин.
К 1 мл надосадочной жидкости добавляют 3 мл рабочего реактива и осторожно перемешивают. Постепенно начинает развиваться окраска, которая при обычной комнатной температуре достигает максимума через 13–15 мин, а затем постепенно уменьшается. Фотометрируют всегда через один и тот же промежуток времени после добавления рабочего реактива в кюветах с длиной оптического пути 1 см с красным светофильтром (длина волны 625 нм) против холостого опыта, который ставят одновременно с рабочими пробами, но вместо крови берут физиологический раствор хлорида натрия. При приготовлении калибровочного графика вместо проб крови берут 0,1 мл соответствующего калибровочного раствора.
Расчет можно проводить по правилу пропорций или по калибровочному графику, для построения которого на одной оси откладывают концентрацию глюкозы (ммоль/л), а на другой – величину экстинкции.
Примечания
1. Можно сначала выпустить кровь из пипетки в изотонический раствор хлорида натрия, а затем добавить растворы сульфата цинка и NaOH.
2. При систематической работе нет необходимости постоянно строить калибровочный график по всем точкам, достаточно ежедневно обрабатывать холостую пробу и 2–3 точки в диапазоне 3–9 ммоль/л, а полный калибровочный график строить лишь при смене реактивов или налаживании методики.
Изучение углеводного обмена методом нагрузок
Исследование углеводного обмена в клинике обычно начинают с анализа мочи на присутствие сахара и кетоновых тел, поскольку появление последних тесно связано с нарушениями углеводного обмена.
Таблица 14
Диагностический уровень концентрации глюкозы (ммоль/л)
Диагноз сахарного диабета подтверждается наличием гипергликемии. Диагноз диабета ставится при уровне глюкозы натощак более 7,8 ммоль/л или если при случайном определении он составляет 11,1 ммоль/л (табл. 15).
Глюкозурия не может подтверждать диагноз, так как глюкоза в моче может появиться в результате нарушения канальцевой реабсорбции.
У части пациентов уровень глюкозы в крови может быть повышен, но не достигать значений, при которых ставится диагноз «сахарный диабет». В этих случаях за пациентами устанавливают наблюдение, им рекомендуют диету с ограничением приема углеводов. В данном случае говорят о «нарушении толерантности к глюкозе». Тест на толерантность к глюкозе (ТТГ) проводят в случае, если диагноз не ясен:
1) сомнительные результаты при исследовании глюкозы крови натощак или случайно;
2) неожиданная глюкозурия, в том числе при беременности;
3) клинические признаки сахарного диабета при нормальном уровне глюкозы крови;
4) диагностика акромегалии.
Тест на толерантность к глюкозе
Тест на толерантность к глюкозе заключается в следующем.
Пациент в течение 3 дней должен придерживаться обычного питания с содержанием углеводов не более 250 г в день, а перед исследованием не наедаться на ночь. Утром натощак у больного берут кровь из пальца для определения содержания глюкозы, после чего ему дают выпить заранее приготовленный раствор, содержащий 75 г глюкозы в 200 мл теплой кипяченой воды или в 200 мл жидкого чая с лимоном. Глюкоза может быть заменена сахаром.
Время, в течение которого обследуемый больной пьет раствор, не должно превышать 5 мин, затем через 60 и 120 мин у него берут из пальца кровь для определения уровня глюкозы.
У детей сахарную нагрузку проводят так же, как и у взрослых, изменяя лишь дозы вводимой глюкозы. Так, детям в возрасте от 1,5 до 3 лет следует давать глюкозу исходя из соотношения 2 г/кг; от 3 до 12 лет – 1,75 г/кг; после 12 лет – 1,25 г/кг, но не более 25 г глюкозы.
На основании полученных данных строят кривую, откладывая на вертикальной оси концентрацию сахара в ммоль/л, а на горизонтальной – время в минутах.
Гликемические кривые у детей имеют тот же характер, что и у взрослых, с тем лишь отличием, что повышение концентрации сахара в крови у детей достигает меньших величин.
Референтные пределы уровня глюкозы при проведении ТТГ (ммоль/л): натощак – 3,9–5,8; через 30 мин – 6,1–9,4; через 60 мин – 6,7–9,4; через 90 мин – 5,6–7,8; через 120 мин – 3,9–6,7.
В конце пробы у больного собирают мочу для исследования на наличие сахара. Установлено, что сахар в моче здоровых людей при этой нагрузке приблизительно в половине случаев не появляется вовсе либо отмечается только в момент наибольшего повышения его в крови, т. е. в промежутке от 30 до 60 мин. Если в моче обнаруживается сахар, то в большинстве случаев это свидетельствует о той или иной форме эндокринной глюкозурии. Из неэндокринных заболеваний только тяжелое поражение печени может привести к появлению глюкозы в моче при проведении данной пробы, но и то в небольших количествах.
При подборе лечения больным сахарным диабетом назначают проведение гликемических и глюкозурических профилей с исследованием уровня глюкозы каждые 3 ч. Исследование глюкозы проводят перед каждым приемом пищи и на ночь. Чтобы не пропустить ночную гипогликемию, определяют глюкозу в ночное время. При проведении глюкозурического профиля мочу собирают в промежутках между исследованиями крови.
Назначение профилей преследует 2 задачи:
1) определить дозы инсулина;
2) оценить питание больного и избежать гипогликемических состояний.
При сахарном диабете уровень сахара крови натощак бывает повышенным, нарастание гликемической кривой происходит медленнее, достигая через 60–150 мин значительной величины (более чем на 80 % выше исходного уровня сахара крови). Снижение же кривой затягивается, гипогликемическая фаза спада за время проведения пробы обычно не выявляется (отсутствует). Нагрузка глюкозой сопровождается в большинстве случаев появлением сахара в моче.
Чем тяжелее диабет, тем позже достигает максимума гликемия, и тем он выше. Понижение кривой происходит очень медленно, чаще оно растягивается на 3–4 ч. Все порции мочи, как правило, содержат сахар. Подобный характер кривой можно объяснить нарушением выделения инсулина, что влечет за собой замедление отложения гликогена и торможение окисления глюкозы.
Повреждение печени характеризуется быстро нарастающей гликемической кривой в результате ослабления ассимиляционной способности печени.
Однако максимальный подъем не достигает таких величин, как при диабете.
Заболевания щитовидной железы, связанные с ее гиперфункцией, характеризуются гликемическими кривыми с более быстрым, чем в норме, нарастанием концентрации сахара, что, возможно, связано с более интенсивным обменом веществ и возбуждением симпатического отдела вегетативной нервной системы.
Причины гипергликемии: сахарный диабет у взрослых и детей, физиологические факторы (энергичные физические упражнения, сильные эмоции, выброс адреналина при инъекциях, шоке, ожогах, инфекциях), эндокринные заболевания (феохромоцитома, тиреотоксикоз, акромегалия, гигантизм, синдром Кушинга, глюкагонома, соматостатинома), заболевания поджелудочной железы (острый и хронический панкреатит, панкреатит при паротите, муковисцидозе, гемохроматозе, опухоли поджелудочной железы), гипергликемии, связанные с кровоизлиянием в мозг, острым инфарктом миокарда, тяжелой стенокардией, хроническими заболеваниями печени, хроническими заболеваниями почек.
Гипергликемия может сопровождаться глюкозурией, особенно в тех случаях, когда содержание сахара в крови превышает почечный порог (при упомянутых выше патологических состояниях почечный порог для глюкозы может и снижаться).
Причины гипогликемии: опухоль островковых клеток, дефицит глюкагона, другие опухоли (рак надпочечников, рак желудка, фибросаркома), тяжелые заболевания печени (отравления мышьяком, тетрахлоридом углерода, хлороформом и др.), эндокринные заболевания (гипопитуитризм, болезнь Аддисона, гипотиреоз), функциональные нарушения (постгастроэктомические синдромы, гастроэнтеростомия, поражения вегетативной нервной системы), у детей – недоношенность, рождение от матери, больной сахарным диабетом, кетонемическая гипогликемия.
Методы исследования активности ферментов
Определение активности ферментов наиболее широко используется при диагностике как первичных врожденных ферментопатий, так и вторичных, т. е. развивающихся в результате патологических нарушений на клеточном и субклеточном уровнях.
Изменение активности одних и тех же ферментов может наблюдаться при самых различных заболеваниях и, следовательно, не является специфичным для какой-либо патологии.
В связи с этим определение активности ферментов имеет диагностическую значимость только при сопоставлении с изменениями других показателей и клинической картиной заболевания в целом.
Чаще всего для определения активности ферментов в клинико-диагностических лабораториях используют плазму. Ферменты, выявляемые в плазме, условно делятся на 3 группы:
1) собственные ферменты плазмы, выполняющие свои функции только в сосудистом русле (ферменты свертывания крови, холинэстераза, церулоплазмин);
2) экскреторные ферменты, попавшие в плазму из секретов (дуоденального сока, слюны);
3) клеточные ферменты, попавшие в плазму из поврежденного органа.
Появление, степень, длительность сдвига ферментативной активности ферментов в плазме или сыворотке крови обусловлены несколькими причинами: размерами и степенью повреждения клеток, величиной молекул фермента, его внутриклеточной локализацией, прочностью связей со структурными элементами клеток, влиянием разных факторов на активность и скорость деградации фермента в клетках.
Каждый орган в организме имеет определенный спектр ферментов. Его характеристикой может быть более или менее типичная группа ферментов, типичная энзиматическая констелляция. Это позволяет с помощью определения группы органоспецифических ферментов получать сведения о функциях отдельных органов организма. Обычно ферментодиагностика – это определение ряда ферментов. Моноорганоспецифических ферментов практически не существует.
Измеряемая в сыворотке крови активность ферментов – результат совместной и согласованной работы клеточных структур (процессов синтеза и распада ферментов), функции мембран, скорости инактивации. Кроме того, на активность ферментов в крови значительное влияние оказывает продолжительность жизнедеятельности. Для основного числа ферментов период полураспада составляет от 10 до 120 ч. При этом ферменты с коротким периодом полураспада лучше отражают процессы, протекающие в органе.
Определение активности ферментов в сыворотке или плазме крови начато с 1954 г., когда было выяснено диагностическое значение нарастания активности ACT и АЛТ. Последующие годы подтвердили, что ряд заболеваний (в первую очередь инфаркт миокарда) вызывает преходящий подъем активности ряда ферментов плазмы и сыворотки крови. Каждый фермент в процессе заболевания отличает время первоначального появления в сыворотке и плазме, достижение максимальной активности, инактивация.
По мере развития патологического процесса в органе происходят прогрессирующее нарушение целостности клеточных стенок и утечка ферментов.
В плазме или сыворотке накапливается добавочное количество ферментов, набор которых характеризует их состав в пораженном органе. Абсолютное повышение активности определенного фермента связано со степенью повреждения ткани, его активность зависит от молекулярной массы и количества фермента в органе. Длительность периода полураспада ферментов является главным фактором, определяющим период времени, когда активность фермента повышена в плазме или сыворотке крови.
Определение активности аминотрансфераз (АЛТ, АСТ)
АЛТ (АлАТ) присутствует в очень больших количествах в печени и почках, в меньших – в скелетных мышцах и сердце. ACT (АсАТ) распределена во всех тканях тела. Наибольшая активность имеется в печени, сердце, скелетных мышцах и эритроцитах.
Принцип метода
Аспартат-аминотрансфераза катализирует реакцию между L-аспартатом и 2-оксоглутаратом, в результате которой они превращаются в L-глутамат и оксалацетат. Определение основано на измерении оптической плотности гидразонов 2- оксоглутаровой и пировиноградной кислот в щелочной среде. Гидразон пировиноградной кислоты, возникающий при самопроизвольном декарбоксилировании оксалацетата, обладает более высокой оптической плотностью.
Аланин-аминотрансфераза катализирует реакцию между L- аланином и 2-оксоглутаратом, в результате которой они превращаются в L-глутамат и соль пировиноградной кислоты. Определение основано на измерении оптической плотности гидразонов 2-оксоглутаровой и пировиноградной кислот в щелочной среде. Гидразон пировиноградной кислоты обладает более высокой оптической плотностью.
Повышенное содержание кетоновых тел (в сыворотках больных диабетом) вызывает завышение активности ферментов ACT и АЛТ.
Гемолиз повышает активность ACT или АЛТ в сыворотке крови. Снижение результатов вызывают синтетические моющие средства.
Пределы активности:
АЛТ 5 – 30 Ед/л × 0,017 или 0,09–0,51 мккат/л;
ACT 7–18 Ед/л × 0,017 или 0,12–0,31 мккат/л.
Метод определения активности АСТ
Необходимые реактивы
1. Калия фосфат однозамещенный (КН2РО4).
2. Калия фосфат двузамещенный (К2НРО4 × 3Н2О).
3. L-аспарагиновая кислота или L-аспарагиновой кислоты натриевая соль.
4. Фосфатный буфер 0,1 моль/л, рН 7,4: 0,16 г однозамещенного фосфата калия и 2,07 г двузамещенного фосфата калия трехводного растворяют в 40–160 мл воды, проверяют рН и доводят водой в мерной колбе до 100 мл. Стабилен при хранении в холодильнике.
5. Субстратно-буферный раствор 0,25 моль/л L-аспарагиновой кислоты в 0,1 моль/л фосфатном буфере рН 7,4: 3,30 г L- аспарагиновой кислоты (или 3,9 г натриевой соли L-аспарагиновой кислоты) растворяют в 40–50 мл 0,1 моль/л фосфатного буфера, проверяют рН и доводят фосфатным буфером в мерной колбе до 100 мл. Если применяют L-acпaрагиновую кислоту, то к навеске перед растворением в фосфатном буфере для установления рН 7,4 добавляют примерно 20–26 мл 1 моль/л раствора едкого натра и затем проверяют рН. Стабилен при хранении в холодильнике в течение месяца.
6. β-никотинамидадениндинуклеотид восстановленный, динатриевая соль, 15 ммоль/л: 16 мг НАДH × Na2 × 4H2O растворяют в 1,5 мл воды. Раствор стабилен в течение 2 недель при хранении в темной посуде в холодильнике. Коэффициент молярного поглощения не ниже 5,6 × 102 м2 × моль–1 при 340 нм.
7. α-кетоглутаровая кислота, 0,45 моль/л: 0,2 г α-кетоглутаровой кислоты растворяют в 2,5 мл воды и добавляют 5 моль/ л раствора едкого натра. Если используют динатриевую соль α- кетоглутаровой кислоты, то 0,26 г соли растворяют в 3 мл воды, раствор стабилен в течение 2 недель при хранении в холодильнике. α-кетоглутаровая кислота не должна содержать примесей пирувата и малата.
8. Малатдегидрогеназа из сердца свиньи (L-малат: NAD + оксидоредуктаза). Суспензия в 50 %-ном растворе глицерина. Специфическая каталитическая активность выше 17 ммоль/(с × л). Примеси: АсАТ < 0,01 %, ГлДГ < 0,003 %, ЛДГ < 0,01 %. Для приготовления рабочего раствора к 20 мкл суспензии добавляют 5 мл воды.
9. Лактатдегидрогеназа из скелетной мышцы кролика или свиньи. Суспензия в 50 %-ном растворе глицерина. Специфическая каталитическая активность выше 8 ммоль/(с × л). Примеси: АсАТ < 0,01 %, ГлДГ < 0,003 %, АлАТ < 0,01 %. Для приготовления рабочего раствора к 40 мкл суспензии добавляют 5 мл воды. Стабилен в течение 3 месяцев при хранении в холодильнике в хорошо укупоренной посуде.
10. Натр едкий, 5 моль/л; 1 моль/л.
11. Натрия хлорид, 154 ммоль/л (физиологический раствор).
Примечание
Для определения активности АсАТ и АлАТ по оптическому тесту используют отечественные реактивы или импортные, например реактивы фирмы «Reanal». Все реактивы готовят на бидистиллированной воде, хранят при температуре от 0 до +4 °C. Уменьшение стабильности может наступить за счет роста микроорганизмов.
Поэтому в растворы рекомендуется добавлять несколько капель хлороформа.
Специальное оборудование
Спектрофотометр с термостатированной кюветой. Измерение проводят при 340 нм.
Ход определения
Перед определением температура растворов и сыворотки должна быть доведена до температуры измерения. Перед работой можно готовить смесь реактивов, состоящую из субстратно-буферного раствора, раствора НАДН, МДГ и ЛДГ в соотношении 60: 1: 1: 1. Определение проводят по следующей схеме (табл. 15).
Таблица 15
Определение активности АСТ
Перемешивают и через 60 с (лаг-фаза) измеряют экстинкцию и одновременно включают секундомер. Точно через 1, 2, 3 мин (или через более короткие, но равные промежутки времени) измеряют экстинкцию.
Поправку на холостой опыт проводят по формуле:
(ΔЕ / Δt)оп – (ΔЕ / Δt)хол = (ΔЕ / Δt)скор.
Скорректированную величину опытной пробы используют в дальнейших Расчетах. Расчет производят по формуле:
Активность, моль / (с × м3) = нмоль / (с × л) × 106 =
= Vр. с / ε × l × Vсыв × (ΔЕ / Δt)скор,
где Vр. с – объем реакционной смеси, мл;
Vсыв – объем сыворотки, мл;
t – время реакции, с;
ΔЕ / Δt – изменение экстинкции за 1 с;
ε – коэффициент молярной экстинкции НАДН в м2 × моль–1;
l – толщина слоя жидкости в кювете в сантиметрах.
Примечание
Определение активности фермента можно проводить по микрометоду. Для этого перед работой готовят смесь реактивов, состоящую из субстратно-буферного раствора, растворов НАДН, ЛДГ, МДГ в соотношении 60: 1: 1: 1. Опытная проба включает смесь реактивов – 0,630 мл, сыворотку – 0,10 мл, α- кетоглутаровую кислоту – 0,02 мл. Холостую пробу ставят так же, как опытную, но вместо сыворотки добавляют 154 ммоль/л раствор хлорида натрия. Определение проводят по той же схеме, что и в макрометоде.
Метод определения активности АЛТ
Необходимые реактивы
1. Калия фосфат однозамещенный (КН2РО4).
2. Калия фосфат двузамещенный (К2НРО4 × 3Н2О).
3. Фосфатный буфер, 0,1 моль/л, рН 7,4: 0,16 г однозамещенного фосфата калия и 2,07 г двузамещенного фосфата калия трехводного растворяют в 40–60 мл воды, проверяют рН и доводят водой в мерной колбе до 100 мл. Стабилен при хранении в холодильнике.
4. L-aльфа-аланин.
5. Субстратно-буферный раствор, 0,63 моль/л L-аланина в 0,1 моль/л фосфатном буфере, рН 7,4: 5,62 г L-аланина растворяют в 80 мл 0,1 моль/л фосфатного буфера, проверяют рН и доводят фосфатным буфером в мерной колбе до 100 мл. Стабилен в течение 2 месяцев при хранении в холодильнике.
6. β-никотинамидадениндинуклеотид восстановленный, динатриевая соль, 15 ммоль/л (коэффициент молярной экстинкции не ниже 5,6 × 102 м2 × моль–1 при 340 нм): 16 мг НАДН × Na2 4H2O растворяют в 1,5 мл воды. Раствор стабилен в течение 2 недель при хранении в темной посуде в холодильнике.
7. Натр едкий, 5 моль/л.
8. α-кетоглутаровая кислота, 0,56 моль/л: 0,245 г α-кетоглутаровой кислоты растворяют в 2,5 мл воды и добавляют 0,5 мл 5 моль/л раствора едкого натра. Если используют динатриевую соль α-кетоглутаровой кислоты, то 0,318 г соли растворяют в 3 мл воды. Раствор стабилен в течение 2 недель при хранении в холодильнике.
9. Лактатдегидрогеназа из скелетной мышцы кролика или свиньи, суспензия в 50 %-ном растворе глицерина. Специфическая каталитическая активность выше 8 ммоль/(с × л). Примеси: АсАТ < 0,01 %, ГлДГ < 0,003 %, АлАТ < 0,01 %. Для приготовления рабочего раствора к 45 мкл суспензии добавляют 5 мл воды. Стабилен в течение 3 месяцев при хранении в холодильнике.
10. Натрия хлорид, 154 ммоль/л (физиологический раствор).
Все реактивы лучше готовить на бидистиллированной воде.
Специальное оборудование то же, что для АсАТ.
Ход определения
Перед определением температура растворов и сыворотки должна быть доведена до температуры измерения. Перед работой можно готовить смесь реактивов, состоящую из субстратно-буферного раствора, раствора НАДН и ЛДГ в соотношении 60: 1: 1. Определение проводят по следующей схеме (табл. 16).