О. А. Белов

ДНК-идентификация при противодействии преступности

Учебное пособие

ebooks@prospekt.org

Информация о книге

УДК 343.98(075.8)

ББК 67.52я73

Б43

Автор:
Белов О. А., кандидат юридических наук, доцент, доцент кафедры криминалистики Московского государственного юридического университета имени О. Е. Кутафина (МГЮА).

Рецензенты:
Ищенко Е. П., доктор юридических наук, профессор, заслуженный юрист Российской Федерации, заслуженный деятель науки Российской Федерации, заведующий кафедрой криминалистики Московского государственного юридического университета имени О. Е. Кутафина (МГЮА);
Хмелёва А. В., кандидат юридических наук, и. о. руководителя управления научно-исследовательской деятельности (научно-исследовательского института криминалистики) Главного управления криминалистики (Криминалистического центра) Следственного комитета Российской Федерации.

В учебном пособии в доступной форме рассмотрены вопросы возникновения, современного состояния, а также перспективы развития методов ДНК-анализа, применяемых в целях раскрытия и расследования преступлений.

Законодательство приведено по состоянию на 1 мая 2022 г.

Пособие рекомендовано обучающимся, преподавателям, сотрудникам правоохранительных органов, судьям, всем, кого интересуют возможности проведения молекулярно-генетических исследований в целях криминалистической идентификации личности.

Учебное пособие подготовлено в рамках программы стратегического академического лидерства «Приоритет-2030».

УДК 343.98(075.8)

ББК 67.52я73

© Белов О. А., 2022

© ООО «Проспект», 2022

ВВЕДЕНИЕ

Наблюдающийся в последние годы рост преступности, увеличение количества тяжких преступлений против личности вызывают необходимость профессионального подхода к изучению и использованию при расследовании преступлений различных доказательств. Определенную роль в этом процессе играют интеграция и дифференциация смежных научных отраслей знания — криминалистики, биологии и судебной медицины, что способствует объективизации процесса расследования преступлений.

Практика показывает, что с мест происшествий, помимо следов рук, обуви, транспортных средств, все чаще изымаются микроследы, в том числе биологического происхождения (волосы, перхоть, слюна, кровь и др.).

Установление лица, оставившего биологические следы, занимает центральное место в криминалистической идентификации и в методике расследования преступлений.

Внедрение новых методов обнаружения, фиксации и изъятия следов биологического происхождения, а также дальнейшее исследование таких следов позволяют расширить возможности использования в судопроизводстве извлекаемой из них доказательственной информации.

Биология уже давно заняла свое почетное место в криминалистических лабораториях, и такая непростая задача, как идентификация личности, представляется сегодня невозможной без использования методов этой науки. Внедрение биологических методов анализа в процесс производства судебной экспертизы имеет давнюю историю. Сначала на помощь дактилоскопии, имеющейся в арсенале у криминалистов с 1892 г., пришло серологическое типирование молекул, находящихся в биологических жидкостях, таких как маркеры групп крови АВ0, а также некоторых ферментов.

Однако классические методы идентификации личности по следам биологического происхождения, основанные на сравнительном анализе морфологических признаков, имеют предел идентификационных возможностей. С развитием методов молекулярной генетики появилась перспектива существенно расширить возможности судебно-медицинской идентификации посредством использования методов ДНК-анализа.

В 1985 году генетиком Алексом Джеффрисом был предложен первый метод, позволяющий проводить генетическую идентификацию биологических объектов судебной экспертизы, получивший название «ДНК-дактилоскопия» или «геномная дактилоскопия» по аналогии с классической дактилоскопией. В опубликованной Джеффрисом в журнале Nature статье «Индивидуально-специфичные “отпечатки пальцев” ДНК человека» термин «отпечатки пальцев» («фингерпринт») был употреблен иносказательно и к традиционной дактилоскопии, конечно же, никакого отношения не имеет. Несмотря на это, термин «ДНК-дактилоскопия» стал нарицательным для современных методов генетического анализа, проводимых в целях криминалистической идентификации личности, и очень часто используется в различных научных трудах, посвященных вопросам молекулярно-генетических исследований биологических веществ по уголовным делам.

В настоящее время ДНК-анализ является наиболее эффективным и современным методом исследования следов биологического происхождения, который используется в экспертных подразделениях для установления происхождения биологического следа от конкретного лица, определения родства, половой принадлежности биологического материала и идентификации неопознанных трупов.

Методы ДНК-анализа позволяют провести идентификацию человека со 100%-й вероятностью при сравнении данных ДНК, полученных из следов биологического происхождения, изъятых с мест происшествий, и данных ДНК образцов крови или иного биологического материала, представленных для сравнения.

Современное лабораторное оборудование и методики экспертного анализа позволяют использовать для исследования ДНК минимальное количество биологического вещества. В следственной практике стало возможным изучать микроследы биологического происхождения и объекты с сильно разрушенной ДНК, такие как обгоревшие костные фрагменты, единичные волосы, следы потожировых выделений, перхоть, микроследы спермы, слюны и крови. Кроме того, производство идентификационных экспертиз биологических объектов проводится в короткие сроки и с высокой точностью, что особенно актуально в связи с необходимостью исследования постоянно возрастающего объема биологического материала, изымаемого с мест происшествий.

Методы ДНК-анализа, которые ведущими международными экспертами характеризуется как наиболее важный технологический прорыв со времен изобретения традиционной дактилоскопии, уже давно доказали перспективность их использования при расследовании преступлений.

Глава 1.
ИСТОРИЧЕСКИЕ ПРЕДПОСЫЛКИ ВОЗНИКНОВЕНИЯ ДНК-ИДЕНТИФИКАЦИИ

§ 1. Наследственность: от теории Менделя до евгеники и генетики

Человечество с незапамятных времен обращало внимание на то, что близкие родственники очень часто похожи друг на друга. Это сходство проявляется в основном во внешнем облике человека (рост, телосложение, черты лица, цвет волос и пр.). Некоторые внутренние черты (например, характер, поведение) родители иногда также видели в своих детях.

Наши предки, скорее всего, догадывались о наследственных механизмах передачи генетической информации от поколения к поколению, однако на протяжении многих веков объяснить природу этого явления никому не удавалось.

Явление наследственного сходства родителей и их потомства у людей, животных и растений привлекало внимание многих философов и врачей, которые пытались предложить для объяснения этого явления различные гипотезы. Первая из таких попыток принадлежит древнегреческому философу Гиппократу, полагавшему, что экстракты из организма собираются в мужских и женских зародышевых элементах, после чего служат причиной, определяющей особенности развития зародыша.

Демокрит также придерживался материалистических воззрений на явление наследственности и считал, что мужской и женский пол равноправны в наследственности, благодаря материальным частицам, передаваемым как отцом, так и матерью.

Идеалистическую идею в проблеме наследственности высказывал Аристотель, считавший, что наследственность, определяющая развитие организма, представляет собой нематериальное начало, которое он назвал энтелехией. По Аристотелю, материю для развития организма в виде пассивного начала дает мать. Энтелехия в виде духа, активного, нематериального начала, вносится со стороны отца.

До XIX века слова «наследственность» и «наследование» использовались практически исключительно в социальной сфере. С середины XIX столетия изучение явлений наследственности приобрело научный характер. Именно в это время французский врач и ученый Проспер Люк пишет свой труд «О естественной наследственности» (1847–1850 гг.), в котором содержится обширный фактический материал о наследовании различных особенностей у человека. На основании своих исследований он устанавливает три типа наследственности: избирательную, когда признаки получаются от одного родителя; смешанную, когда происходит смешение родительских свойств, и комбинативную, связанную с появлением новых признаков. Несколько позже, в 1886 году, Эрнст Геккель предложил иную классификацию явлений наследственности, проведя в ней впервые ясное различие между наследованием прирожденных и наследованием приобретенных свойств под именем закона консервативной и закона прогрессивной наследственности.

Чарльз Дарвин, один из основоположников эволюционной теории, также интересовался вопросами наследственности. Он был приверженцем популярной идеи, что черты отдельной особи есть результат смешения, что-то вроде среднего значения признаков ее родителей.

Однако точку отчета современной генетики многие ученые связывают с исследованиями, проведенными монахом-августинцем, чешско-австрийским биологом Грегором Иоганном Менделем.

В Университете Оломоуца и в институте в г. Брно, куда молодой монах ходил на занятия, Мендель встретил ученых, интересовавшихся наследственностью¹.

Будучи в Вене, Мендель заинтересовался процессом гибридизации растений и, в частности, разными типами гибридных потомков и их статистическими соотношениями.

Он начал ставить эксперименты на мышах и пчелах, однако в итоге остановился на горохе, так как последний имеет ряд преимуществ: быстро растет, не занимает много места, способен к самоопылению и опылению вручную (с помощью кисточки). Вдобавок ко всему, большинство признаков гороха, которые выбрал для сравнения Мендель, передаются по отдельности (позже ученые выяснили, что гены, расположенные в ДНК недалеко друг от друга, часто наследуются в связке).

В начале исследований Мендель создал условия для самоопыления растений, во время которого у каждого поколения горошка проявлялись одни и те же признаки: высота и цвет кустов, форма стручков и горошин и др. Следующим этапов его изысканий стало скрещивание непохожих по данным признакам кустов. Если бы была верна гипотеза о том, что в потомках смешиваются черты родителей, то полученные гибриды высокого и низкого гороха должны были быть среднего размера, а гибрид зеленого и желтого имел бы промежуточный цвет. Однако во втором поколении горох напоминал только одного родителя.

Тогда Мендель стал скрещивать получившиеся гибриды — и потерявшиеся во втором поколении черты вернулись. Например, у исходных кустов с гладкими горошинами и кустов с морщинистыми получилось исключительно «гладкое» потомство, но примерно четверть «внуков» оказалась морщинистой. Именно это и натолкнуло Менделя на мысль, что каждый признак определяют два «фактора» — отцовский и материнский.

У исходных «чистых» кустов с гладкими (Г) и морщинистыми (М) горошинами факторы совпадали: ГГ и ММ. Во втором поколении получились только гибриды ГМ, а в третьем были растения четырех типов: ГГ, ММ, МГ и ГМ. Поскольку комбинации складывались с одинаковой вероятностью, а две последние, по сути, были одинаковыми, то половина «внуков» оказалась гибридами ГМ, четверть — ГГ, а еще четверть — ММ. Мендель заключил, что морщинистым был только горошек ММ, а в кустах ГМ фактор гладкости (доминантный) побеждал фактор морщинистости (рецессивный), так как во втором поколении гладкими были все растения, а в третьем — только три четверти².

Мендель записывал и анализировал данные, вырастив почти 30 тыс. кустов гороха. Вместе с подготовительным этапом и итоговыми вычислениями у него и его помощников ушло на это целых девять лет. Закономерность была налицо: доминантные признаки проявлялись в три раза чаще рецессивных. Погрешность была настолько мала, что в XX веке Менделя заподозрили в подтасовке результатов. Но, так или иначе, гипотеза, объясняющая эти результаты, оказалась верной.

В 1865 году Мендель выступил с докладом в Обществе естественной истории в г. Брно, но коллег его идеи не впечатлили, потому что противоречили популярной гипотезе о смешивании признаков и опирались на математические вычисления, а в биологии это было не принято. Вскоре Мендель по результатам своих работ опубликовал статью, однако многие увидели в ней отчет об исследовании гибридов, а не труд о наследственности.

Мендель своими опытами доказал, что гипотеза Чарльза Дарвина неверна, так как черты определяются двумя факторами: отцовским и материнским, но в особи проявляется только один, доминантный, а второй, рецессивный, скрыт. Позднее ученые стали называть эти факторы «генами».

В дальнейшем открытие Менделя было подтверждено опытами других ученых, которые стали пристально изучать внутриклеточные структуры. Такая возможность появилась благодаря постоянному совершенствованию оптики микроскопов, а также открытию швейцарским врачом Иоганном Фридрихом Мишером дезоксирибонуклеиновой кислоты³. Именно тогда возник термин «хромосома», которым ученые стали именовать продолговатые нитевидные тельца в ядре клетки. Таким образом, только в 1902 году удалось найти связь между хромосомами и теорией Менделя.

Важный вклад в признание мировой биологической наукой учения Менделя о наследственности внес ученый из Великобритании Уильям Бэтсон, издавший в 1902 году книгу «Менделевские принципы наследственности».

В 1906 году Бэтсон первым предложил термин «генетика» для обозначения учения о наследственности как отдаленного направления биологической науки.

Идею Менделя о существовании в организме гипотетических наследственных факторов, обеспечивающих независимую передачу каждого отдельного наследственного признака, поддержал и ученый из Дании Вильгельм Людвиг Иогансен. В 1909 году для обозначения этих факторов им был предложен термин «ген», а совокупность генов всего организма Иогансен обозначил термином «генотип».

Изучению хромосом посвятил свои научные исследования Уолтер Саттон, который понимал, что последние во многом напоминают таинственные «менделевские факторы». Исследуя хромосомы кузнечиков, Саттон заметил, что эти маленькие тельца (хромосомы), как правило, встречаются попарно — точно так же, как парные факторы Менделя. При этом ученый установил существование других клеток, в которых хромосомы были непарными, — гамет, то есть половых клеток. В сперматозоидах кузнечика был выявлен одиночный, а не двойной набор хромосом. Именно это описывал в своих опытах с горохом Мендель: в спермиях гороха также содержалось только по одной копии каждого из наследственных факторов. Стало очевидно, что «факторы» Менделя, ныне именуемые «генами», располагаются в хромосомах⁴.

Другой ученый из Колумбийского университета — Томас Хант Морган, исследуя хромосомы, не мог понять, как с их помощью можно объяснить изменения, передаваемые от предков потомству. Он рассуждал так: «если все гены расположены в хромосомах, а хромосомы передаются из поколения в поколение целыми и невредимыми, значит, большинство признаков должны наследоваться вместе». Однако на практике эти данные не подтверждались. Тогда Морган начал проводить исследования мушек-дрозофил (Drosophila melanogaster).

Задача, которую он поставил перед собой, — найти среди дрозофил «мутантов», то есть таких мушек, которые выделялись бы в популяции. Вскоре такие мутанты были найдены — дрозофила с белыми, а не с красными (как у большинства мушек) глазами. Морган также заметил, что белоглазые дрозофилы в большинстве своем являются самцами. К тому времени уже было известно, что пол плодовой мушки определяется на уровне хромосом: самка имеет две X-хромосомы, а самец — одну X-хромосому и одну Y-хромосому.

Исходя из полученных данных, белоглазость дрозофил оказалась вполне объяснима: ген, отвечающий за цвет глаз, находится в X-хромосоме, а мутация, дающая белый цвет глаз (W), является рецессивной. Поскольку у самцов всего одна X-хромосома, у них автоматически экспрессируются только рецессивные гены, при этом доминантные гены, способные подавить рецессивные, у самцов отсутствуют. Белоглазые самки встречаются сравнительно редко, а поскольку у самок всего одна копия гена W, то, как правило, глаза самок приобретают доминантный красный цвет. Соотнеся ген, отвечающий за красный цвет глаз, с X-хромосомой, Морган фактически доказал теорию Саттона⁵.

Результаты научных исследований Моргана помогли разгадать и другие секреты генетики. Изучая гены, расположенные в одной и той же хромосоме, Морган обнаружил, что хромосомы делятся на части и заново формируются при образовании сперматозоидов и яйцеклеток⁶.

Морган разработал метод составления генетических карт хромосом, который позволял отследить передачу генов и связанных с ними наследственных факторов из поколения в поколение. В 1933 году за открытие хромосомной теории наследственности Томас Морган был удостоен Нобелевской премии по физиологии и медицине.

Пока на протяжении XVIII и XIX веков ученые пытались разобраться в особенностях реализации наследственных механизмов, в обществе сформировалась некая социальная озабоченность по поводу наследственного здоровья человека и путей его улучшения, а также методах влияния на наследственные качества будущих поколений с целью их совершенствования.

После публикации книги Ч. Дарвина «О происхождении видов» в 1859 году, стремление к улучшению самой природы человека приняло в обществе весьма серьезный оборот.

Френсис Гальтон — английский исследователь, географ, антрополог, психолог и статистик, будучи двоюродным братом и другом Чарльза Дарвина, обращал особое внимание на его научные труды.

Ученым-криминалистам Френсис Гальтон больше известен как один из основателей учения о дактилоскопии. В свое время, проанализировав большое количество отпечатков пальцев, полученных от добровольцев, он математически обосновал практическую невозможность совпадения отпечатков пальцев у людей. В своей книге «Отпечатки пальцев», опубликованной в 1892 году, Ф. Гальтон изложил научное обоснование использования отпечатков пальцев в криминалистике.

В книге Ч. Дарвина «О происхождении видов» Гальтона заинтересовала глава «Изменчивость у одомашненных животных». Вдохновленный этим научным трудом, он приступил к тщательному статистическому исследованию изменчивости и наследственности у людей. Результаты своей работы ученый изложил в книге «Наследственный гений». В ней он сделал вывод, что у человека выдающегося гораздо больше шансов иметь выдающегося сына, чем у человека рядового.

В 1883 году в своей книге «Исследование человеческих способностей и их развития» Ф. Гальтон ввел новый термин «евгеника» (что буквально означает «наука о рождении блага») для описания применения основного принципа сельскохозяйственного размножения для человека, а позднее определил евгенику как «науку, занимающуюся всеми факторами, улучшающими врожденные качества расы».

Основываясь на результатах своих научных изысканий и расчетов, ученый выдвинул предположение о возможности «оптимизировать» человеческую популяцию, расширяя репродуктивный потенциал одаренных личностей и ограничивая возможности для размножения менее одаренных представителей общества. Свои исследования по диагностике различий в психических качествах людей Ф. Гальтон использовал для обоснования идеи о необходимости отбора наиболее приспособленных членов общества. Он утверждал, что человеческий род можно улучшить таким же путем, каким выводится новая порода животных, за счет соответствующих браков в течение нескольких поколений⁷.

Со временем последователи Ф. Гальтона стали называть евгенику «самонаправленной эволюцией человека»: они считали, что при сознательном выборе, кому можно иметь детей, существует возможность остановить «евгенический кризис», родившийся в викторианском воображении под впечатлением от чрезмерной плодовитости непривилегированных слоев населения и того, что семьи представителей «благородных» классов обычно невелики. Эта идея была антигуманной, хотя сам Ф. Гальтон видел ее совсем не как социальную, но как важную медицинскую и психологическую проблему учета наследственных факторов в развитии человека⁸.

Последователи его идей, как и он сам, различали негативную и позитивную евгенику. Целью «позитивной евгеники» было содействие воспроизводству людей с признаками, которые рассматриваются как ценные для общества (отсутствие наследственных заболеваний, хорошее физическое развитие и высокий интеллект).

«Негативная евгеника», являясь более радикальной, была нацелена на прекращение воспроизводства лиц, имеющих наследственные дефекты, в том числе наследственные заболевания.

Гальтон был приверженцем «позитивной евгеники», которая рекомендовала генетически благополучным людям иметь детей. Американское евгеническое движение было сфокусировано на «негативной евгенике» и стремилось помешать размножению людей, которые считались генетически неполноценными. В этот период в США, благодаря деятельности тюремного врача из штата Индиана Гарри Шарпа, стали считать стерилизацию превосходным решением «евгенического кризиса».

Вслед за США, стерилизацию стали практиковать в Европе — не только в нацистской Германии, но и в Швейцарии, а также в скандинавских странах.

В России в начале XX века также появились приверженцы идей евгеники. 15 октября 1920 года в Москве при Институте экспериментальной биологии академиком Н. К. Кольцовым было образовано «Русское евгеническое общество», существовавшее до 1929 года. Работа Общества заключалась в изучении фенотипов и генотипов человека, в сборе информации по вопросу о значении биологических факторов в истории, материала по русским семейным хроникам. Члены Русского евгенического общества занимались проблемами положительной евгеники и отвергали евгенику отрицательную.

Евгеника, ставшая весьма популярной в первые десятилетия XX века, впоследствии стала ассоциироваться с нацистской Германией, отчего ее репутация значительно пострадала.

Идеи последователей негативной евгеники были взяты на вооружение приверженцами национал-социализма в Германии. Теория расовой гигиены, нацеленная на «улучшение здоровья нации», была фактическим синонимом евгеники. Ее внедрение привело к массовому уничтожению людей под предлогом «расовой неполноценности» в результате их разделения на «низших» и «высших». Некоторые практики расовой гигиены были тесно связаны с евгеникой: принудительной стерилизации подвергались различные «неполноценные лица»: цыгане, евреи, гомосексуалисты, люди с отклонениями в умственном развитии, душевнобольные и т. д. Впоследствии руководством нацистской Германии было принято решение о большей целесообразности их физического уничтожения.

Нацистские евгенические замыслы сначала проводились в рамках государственной программы «предотвращения вырождения немецкого народа как представителя арийской расы», а впоследствии — и на захваченных территориях других стран в рамках нацистской «расовой политики» вплоть до 1945 года.

В послевоенный период евгеника стала рассматриваться в академических кругах как теоретическая основа преступлений нацизма, таких как практика расовой гигиены, эксперименты нацистов над людьми и уничтожение «нежелательных» социальных групп.

В последующие годы, когда появились новые, более эффективные методы изучения биохимических молекул в связи с быстрым развитием генетики вообще и геномики в частности, евгеника как самостоятельная наука утратила свой смысл и была предана забвению.

§ 2. История открытия и исследования молекулы ДНК

Во второй половине XX века главным направлением развития генетики стали фундаментальные исследования по поиску наследственных факторов на уровне биологических молекул. Началом этого этапа явилось формирование научных представлений о роли дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) как носителя наследственной информации.

Современным методам ДНК-анализа предшествовала целая цепь научных открытий, история которой берет свое начало с середины XIX в., когда Людвиг Тейхман-Ставларски впервые открыл доказательный метод установления наличия крови в следах с помощью химической реакции (раствора поваренной соли и ледяной уксусной кислоты), а в конце XIX в. немецкие ученые Густав Роберт Кирхгоф и Роберт Вильгельм Бунзен разработали надежный метод установления наличия крови с помощью спектроскопии. В то время сам факт установления следов крови на одежде подозреваемого рассматривался как доказательство его вины в совершении преступления. Впоследствии ученые Флоренс и Фрикон систематизировали виды следов крови в зависимости от механизма их образования, что в совокупности с методом установления наличия крови в этих следах придавало исследованиям большую доказательственную силу. Однако со временем сторона защиты сочла эти факты недостаточными, и судебная медицина стала искать другие способы исследования следов крови.

Очень важно было решить вопрос о происхождении крови (от человека или животного). Первые опыты проводились на жидкой крови, видовую принадлежность которой устанавливали по наличию, размеру и форме ядер в клетках. Однако эти методы не были пригодны для исследования следов крови. Решить проблему удалось только в 1899 г., когда русский исследователь-патологоанатом Ф. Я. Чистович открыл реакцию преципитации (образование твердого осадка в растворе в процессе химической реакции), а немецкий бактериолог П. Уленгут использовал это открытие для установления видовой принадлежности крови. Этот метод начал широко применяться и стал неотъемлемой частью любого исследования при проведении экспертиз следов крови, но и его со временем оказалось недостаточно для доказывания факта принадлежности следов конкретному лицу. Как утверждали адвокаты: «Если доказано, что следы крови произошли от человека, то чем эта кровь отличается от крови миллионов других людей, каждый из которых мог оставить эти следы»⁹.

В 1900 году австрийский врач-иммунолог Карл Ландштейнер, работавший в Патолого-анатомическом институте Венского университета, обнаружил, что эритроциты в сыворотке крови могут слипаться (агглютинировать) при смешивании в пробирках с сыворотками других людей. Это было первым доказательством того, что у людей существует вариация крови. В следующем году он сделал однозначное наблюдение, что эритроциты человека агглютинируют только с сыворотками определенных людей. На основании этого он классифицировал кровь человека на три группы, названные им «система АВ0». Позже, в 1907 году, чешский врач Ян Янский открыл четвертую группу крови.

Эти открытия позволили внедрить в практику методики установления групповой принадлежности крови в следах на вещественных доказательствах, а экспертам дали возможность делать вывод о происхождении пятен крови от конкретного лица.

Однако совпадение группы крови имело значение только в совокупности всех доказательств. К тому же стало очевидным, что в большинстве случаев система АВ0 не дает возможности исключить (или подтвердить) происхождение следов от конкретного человека, поэтому ученые продолжили поиски других систем групп крови. Так, в 1927 г. в эритроцитах человека были открыты антигены М и N, а позднее в данной системе MN — антигены S и s.

История развития судебно-биологической экспертизы шла по пути «открытия» новых систем, установление которых в биологическом следе и решает вопрос его происхождения от конкретного человека. Однако не все системы имеют равноценное прикладное значение, что зависит от количества признаков, входящих в каждую из них, и распределения этих признаков в различных популяциях. Чем больше систем исследуется в следе, тем с большей долей вероятности можно установить его происхождение, но слишком малые размеры следа и его состояние не позволяют этого сделать.

Революционным достижением, которое принципиально по-новому позволило подойти к проблеме идентификации по биологическому следу, стало применение методов анализа ДНК, позволяющих исследовать непосредственно молекулу ДНК, кодирующую все биологические признаки человека¹⁰.

В научной литературе, посвященной изучению ДНК, чаще всего можно встретить имена Джеймса Уотсона и Френсиса Крика как ученых, создавших в 1953 г. модель структуры молекулы ДНК. Однако сама молекула была открыта намного раньше и не этими исследователями. Имя же первооткрывателя упоминается далеко не в каждом учебнике, справочнике или энциклопедии.

Первенство открытия дезоксирибонуклеиновой кислоты приписывается молодому швейцарскому врачу Иоганну Фридриху Мишеру. В 1869 г., работая в Германии, он занимался изучением химического состава клеток животных. В качестве объекта своих исследований он выбрал клетки лейкоцитов. Лейкоциты ученый выделял из гнойного материала, так как именно в гное очень много этих белых кровяных телец, выполняющих защитную функцию в организме и уничтожающих микробы. Из местной хирургической больницы ему поставляли повязки, снятые со свежих гнойных ран. Мишер отмывал лейкоциты из ткани бинтов, а затем выделял из отмытых клеток молекулы белков. В процессе исследований ему удалось установить, что кроме белка в лейкоцитах содержится еще какое-то неизученное вещество. Оно выделялось в виде осадка нитевидной или хлопьеобразной структуры при создании кислой среды. При подщелачивании раствора осадок растворялся. Исследуя препарат лейкоцитов под микроскопом, Мишер обнаружил, что в процессе отмывания лейкоцитов разбавленной соляной кислотой от них остаются одни ядра. На основании этого он сделал заключение о том, что в ядрах клеток содержится неизвестное вещество, которое он назвал нуклеином, от латинского слова nucleus, что в переводе означает «ядро».

При более подробном изучении Мишер разработал целую систему выделения и очистки нуклеинов. Выделенное соединение он подверг обработке эфиром и другими органическими растворителями и убедился, что это не жировое соединение, так как оно не растворялось в этих веществах. Не имели нуклеины и белковой природы, так как при обработке ферментами, разлагающими белки, они не претерпевали никаких изменений.

Химический анализ в те времена был несовершенен, неточен и трудоемок. Медленно, но верно ученый провел его и определил, что нуклеин состоит из углерода, водорода, кислорода и фосфора. Фосфорные органические соединения тогда еще были практически не известны, поэтому Мишер сделал заключение, что открыл неизвестный науке класс соединений, содержащихся внутри клетки.

Статью о своем новом открытии он хотел разместить в журнале «Медико-химические исследования», который выпускался его учителем, одним из основателей биохимии Феликсом Хоппе-Зейлером. Но прежде чем печатать материал, учитель решил проверить его данные в своей лаборатории. На это исследование ушел целый год, и только в 1871 г. в одном из номеров журнала работа Мишера была опубликована. Она сопровождалась двумя статьями самого Хоппе-Зейлера и его сподвижника с подтверждением данных о составе и свойствах нуклеинов.

После возвращения в Швейцарию Мишер принял предложение занять место заведующего кафедрой физиологии в Базельском университете. Там он продолжил свои исследования. На новом месте ученый использовал для опытов более приятный и не менее богатый нуклеином материал — молоки лососевых рыб (они до сих пор используются для этих же целей). На берегу богатого лососем Рейна, протекающего через Базель, у него не было недостатка в исследуемом материале.

В 1874 г. Мишер опубликовал статью, в которой утверждал, что нуклеины, обнаруженные им в молоках лососевых рыб, явно связаны с процессом оплодотворения. При этом он никак не связал их с наследственностью. Ученому открытое им соединение показалось таким простым, поэтому он никак не мог предположить, что именно в нем может храниться все разнообразие наследственных признаков живых организмов. Существующие в те времена методы биохимического анализа еще не позволяли обнаружить существенных отличий нуклеинов человека от нуклеинов лосося, тем более распознать столь сложную структуру, которая и до сих пор полностью не распознана.

В конце XIX — начале XX вв., благодаря работам американского биолога Э. Кесселя, немецкого химика Э. Фишера и др., было установлено, что молекулы ДНК представляют собой линейные полимерные цепи, состоящие из многих тысяч соединенных друг с другом мономеров — дезоксирибонуклеотидов четырех типов. Эти нуклеотиды образованы остатками пятиуглеродного сахара дезоксирибозы, фосфорной кислоты и одним из четырех азотистых оснований: пуринов (аденина и гуанина) и пиримидинов (цитозина и тимина). Для обозначения оснований ученые стали использовать начальные буквы их названий на английском или русском (в русскоязычной научной литературе) языке: соответственно A, G (Г), С (Ц) и Т.

Биологическая функция новооткрытого вещества была неясна, и долгое время ДНК считалась запасником фосфора в организме. Более того, даже в начале XX века многие биологи считали, что ДНК не имеет никакого отношения к передаче наследственной информации, поскольку строение молекулы, по их мнению, было слишком однообразным и не могло содержать закодированную информацию. Кроме этого, предполагалось, что ДНК содержится только в клетках животных, пока в 1930-х гг. российским биохимиком А. Н. Белозерским не было доказано, что ДНК является обязательным компонентом всех живых клеток.

Первые доказательства генетической роли ДНК (как вещества наследственности) были получены в 1944 г. группой американских ученых (О. Эйвери и др.), которые в опытах на бактериях однозначно установили, что с ее помощью наследуемый признак может быть перенесен от одной клетки к другой.

К середине XX в. работами английских ученых (А. Тодд и др.) было окончательно выяснено строение нуклеотидов, которые служат мономерными звеньями в молекуле ДНК.

В 1950 г. американский биохимик Эрвин Чаргафф обнаружил существенные различия в нуклеотидном составе ДНК из разных источников. Кроме того, оказалось, что состав нуклеотидов в молекуле ДНК подчиняется ряду закономерностей, главные из которых — равенство суммарного количества пуриновых и пиримидиновых оснований и равенство количества аденина и тинина (А-Т) и гуанина и цитозина (Г-Ц).

В 1953 г. американский биохимик Дж. Уотсон и английский физик Ф. Крик, работая в лаборатории Мориса Уилкинса, на основании рентгеноструктурного анализа кристаллов ДНК и опираясь на данные Э. Чаргаффа, предложили трехмерную модель ее структуры. Согласно этой модели, молекулы ДНК представляют собой две правозакрученные вокруг общей оси полинуклеотидных цепи, или двойную спираль. На один виток спирали приходится примерно 10 нуклеотидных остатков. Эти цепи не связаны ковалентно, а соединяются водородными связями, возникающими между азотистыми основаниями.

В этом же году они опубликовали статью, в которой сделали вывод о том, что вся генетическая информация организма зашифрована в молекуле ДНК в виде биологического кода, представляющего уникальную последовательность, состоящую из бесконечной комбинации всего четырех унифицированных звеньев — нуклеотидов.

В 1962 году Дж. Уотсон и Ф. Крик получили Нобелевскую премию по физиологии и медицине «За открытия, касающиеся молекулярной структуры нуклеиновых кислот и их значения для передачи информации в живых системах».

Таким образом, с момента открытия молекулы ДНК до установления ее истинного предназначения в развитии и функционировании живых организмов (хранение, передача из поколения в поколение и реализация генетической программы) прошло более 80 лет.

Рис. 1.¹¹ Дж. Уотсон и Ф. Крик и их трехмерная модель ДНК¹²

Итогом изучения наследственных факторов на уровне биологических молекул стало формулирование Ф. Криком центральной догмы молекулярной биологии, представляющей универсальный механизм развития всех биологических видов.

В общем виде механизм передачи генетической информации идет от ДНК к белку и имеет три звена:

1) передача информации между двумя молекулами ДНК (процесс репликации);

2) передача информации от молекулы ДНК к молекуле РНК (процесс транскрипции);

3) передача информации от молекулы РНК к белку (процесс трансляции).

В результате дальнейшего развития генетики этот механизм был дополнен вариантами передачи генетической информации от молекулы РНК к молекуле ДНК (обратная транскрипция) и от молекулы РНК к молекуле РНК (репликация РНК).

К середине XX века ученые окончательно пришли к выводу, что материальным носителем генетической информации всех живых организмов является молекула ДНК, которая представляет генетический код, записанный в виде последовательности нуклеотидов. Именно молекула ДНК определяет два основополагающих свойства живых организмов — наследственность и изменчивость.

Достижения фундаментальной генетики стали основой для дальнейших научных исследований (как фундаментальных, так и прикладных), а также разработки генетических технологий и попыток их практического применения.

Рис. 2. Рентгенограмма, на которой запечатлен первый генетический «отпечаток пальца», подготовленный А. Джеффрисом в Лестерском университете (сентябрь 1984 г.)¹³

10 сентября 1984 года британский генетик Алек Джеффрис в процессе изучения в лаборатории Университета г. Лестера одного из новых методов отслеживания генетических отклонений в хромосомной ДНК рассматривал ее рентгеновские снимки и обнаружил, что цепочки ДНК разных людей имеют уникальные последовательности нуклеотидов. Исследуя ДНК, кодирующую миоглобин, ученый обнаружил в геле (то есть в желатиновой матрице, где фрагменты ДНК перемещаются в электрическом поле со скоростью, зависящей от их размера) целое множество минисателлитов — повторяющихся фрагментов ДНК длиной от 15 до 70 пар нуклеотидов. Это выглядело странным, так как большая часть генов содержит «мусорные» фрагменты ДНК, которые не принимаются во внимание при ее считывании РНК — переносчиком генетической информации от ДНК к месту синтеза белков. При внимательном изучении данного явления он пришел к выводу, что образцы ДНК разных людей содержат весьма отличные друг от друга минисателлитные последовательности¹⁴. Это означало, что последовательности ДНК конкретного человека уникальны и составляют его индивидуальный ДНК-профиль, который можно использовать для безошибочной идентификации личности.

Таким образом, уникальность и индивидуальность личности человека как объекта материального мира были доказаны теперь и на молекулярном уровне.

Выводы, сделанные Алеком Джеффрисом, тут же взяли на вооружение правоохранительные органы. Едва Джеффрис опубликовал результаты своего исследования, с ним тут же связались ученые из Министерства внутренних дел Великобритании: в открытии они увидели надежный способ проверять, говорят ли правду иммигранты, заявляющие, что состоят в близком родстве с гражданином Великобритании.

Первым уголовным делом, в котором была применена генетическая экспертиза, стало дело об изнасиловании и убийстве двух девочек в ноябре 1983 года и в июле 1986 года. Новый метод сначала помог установить невиновность ранее задержанного Ричарда Бакленда, а затем и изобличить настоящего убийцу — Колина Питчфорка. Он стал первым преступником, осужденным за убийство на основе полученных в результате «ДНК-дактилоскопии» доказательств.

Впоследствии открытие Джеффриса по идентификации личности на основе ДНК-анализа стали активно применять в криминалистике при проведении судебно-медицинских экспертиз для доказательства причастности или, наоборот, непричастности подозреваемых к преступлениям, в которых они обвинялись.

Позже техника «ДНК-дактилоскопии», открытая Алеком Джеффрисом, начала использоваться повсеместно для установления родства и решения множества других задач, связанных с идентификацией личности.

В СССР исследования по «геномной дактилоскопии» были начаты в 1987 году при непосредственном участии одного из основоположников и ведущих специалистов в области молекулярно-генетической индивидуализации человека П. Л. Иванова. В Институте молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта АН СССР группой ученых, руководимой доктором биологических наук А. П. Рысковым, был получен целый ряд приоритетных результатов и разработан первый отечественный метод мультилокусного типирования ДНК.

В декабре 1988 года на базе Института молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта РАН и Бюро Главной судебно-медицинской экспертизы Минздрава России П. Л. Ивановым была проведена первая в нашей стране молекулярно-генетическая идентификационная экспертиза, позволившая изобличить особо опасного убийцу-маньяка Сопова, орудовавшего в Ивановской области. Он обвинялся в изнасиловании и убийстве двух женщин преклонного возраста.

Эта экспертиза положила начало внедрению методов «геномной дактилоскопии» в практику работы правоохранительных органов России. Тогда же под эгидой Института молекулярной биологии РАН при Бюро Главной судебно-медицинской экспертизы была организована первая в СССР экспертная лаборатория молекулярно-генетической идентификации (ныне отдел молекулярно-генетических научных и экспертных исследований Российского центра судебно-медицинской экспертизы Минздрава России). Лаборатория была призвана освоить новейшие методы анализа биологических следов как объектов судебно-медицинской экспертизы с использованием технологии молекулярно-генетической индивидуализации человека. Ее успешная деятельность подтвердила необходимость активного внедрения методов ДНК-анализа в практику судебно-медицинской службы России.

В 1992–1995 гг. по заданию правительственной комиссии П. Л. Иванов разработал и совместно с британскими и американскими экспертами успешно осуществил уникальную экспертизу по комплексной молекулярно-генетической идентификации останков семьи последнего российского императора Николая II. Благодаря этим и многим другим экспертизам, выполненным П. Л. Ивановым, были существенно расширены возможности экспертного исследования в плане судебно-медицинской идентификации личности и установления родства.

Дальнейшее развитие методов криминалистического ДНК-анализа позволило усовершенствовать технологии исследования практически всех тканей и биологических жидкостей организма человека, содержащих ДНК, биологических объектов, загрязненных микрофлорой, а также микроколичеств биологического материала.

Список использованной литературы

1. Алешкина Т. Н. К истории создания и использования геномной информации при раскрытии и расследовании преступлений // Актуальные проблемы гуманитарных и естественных наук. 2014. № 5 (2). С. 51–55.

2. Белов О. А. Криминалистическое исследование ДНК человека: учебное пособие / Электрон. дан. и прогр. (6 Мб). Саратов: Вузовское образование, 2017. 68 с.

3. Боринская С. А. По следам ДНК: как генетика народонаселения помогает криминалистике / С. А. Боринская, О. П. Балановский, О. Л. Курбатова, Н. К. Янковский // Природа. 2020. № 11 (1263). С. 3–14.

4. Генетические технологии: учебное пособие / В. Б. Агафонов, Д. Ю. Белоусов, Г. В. Выпханова и др.; отв. ред. А. А. Мохов. М.: Юридическая фирма «Контракт», 2022. 184 с.

5. Джеффрис А. Индивидуально специфические «отпечатки пальцев» ДНК человека // Nature. 1985. № 7. С. 76–90.

6. Дубинин Н. П. Генетика. Кишинев: Штиинца, 1985. 536 с.

7. Иванов П. Л. Индивидуализация человека и идентификация личности: молекулярная биология в судебной экспертизе // Вестник Российской академии наук. 2003. Т. 73. № 12. С. 1085–1097.

8. Рысков А. П., Джинчарадзе А. Г., Иванов П. Л. и др Геномная «дактилоскопия» организмов различных таксономических групп: использование в качестве гибридизационной пробы ДНК фага М13 // Генетика. 1988. Т. 24. № 2. С. 227–238.

9. Уотсон Д. ДНК. История генетической революции. СПб.: Питер, 2017. 820 с.

10. Филипченко Ю. А. Генетика. Л.: Типография «Печатный Двор», 1929. 379 с.

Глава 2.
ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ДНК-ИДЕНТИФИКАЦИИ

§ 1. Понятие и сущность генетической идентификации

Развитие криминалистики постоянно сопровождается разработкой новых направлений, способствующих улучшению качественных подходов к расследованию преступлений и установлению истины по уголовным делам. Одним из наиболее важных научных достижений последних десятилетий являются разработка и внедрение в криминалистическую практику нового направления криминалистической идентификации — генетической идентификации личности (ДНК-идентификации).

Разработка теоретических положений генетической идентификации способствовала процессу ее интегрирования в целостную структуру криминалистической идентификации, взаимодействия с другими направлениями судебной медицины и криминалистики, интерпретации ее результатов в общем комплексе доказательств по уголовному делу.

Генетическая идентификация проводится в рамках судебно-медицинской идентификации, методологической основой которой служит теория криминалистической идентификации. Разработка фундаментальных основ этой теории, а также рассмотрение ее применительно к различным областям криминалистики представлены в трудах Потапова С. М., Колдина В. Я., Сегая М. Я., Корухова Ю. Г., Снеткова В. А., Кирсанова З. И., Белкина Р. С., Митричева В. С., Эджубова Л. Г., Селиванова Н. А., Винберга А. И. и других авторов.

Как известно, криминалистическая идентификация — это процесс установления единого конкретного объекта по различным его отображениям из множества других аналогичных ему объектов в целях раскрытия, расследования и предупреждения преступлений.

Концептуально генетическая идентификация базируется на теории криминалистической идентификации и осуществляется на основе ее методологии, однако имеет свои специфические особенности, к числу которых следует отнести объекты исследования, круг задач (вопросов), решаемых в процессе такого исследования, а также методы исследования.

Объекты генетической идентификации. Цель криминалистической идентификации состоит в установлении искомого объекта — объекта, оставившего следы, определенным образом связанные с событием преступления, и подлежащего установлению по этим следам.

При генетической идентификации искомым объектом является лицо (преступник, потерпевший), оставившее следы, содержащие генетический материал (ДНК), или лицо, в отношении которого устанавливается генетическое родство с определенным индивидуумом (например, генетический отец данного ребенка). Проверяемыми объектами служат проходящие по делу лица — подозреваемый, потерпевший, предполагаемый отец ребенка.

В генетической идентификации идентифицируемым объектом являются участки ДНК искомого объекта, определяющие идентификационные свойства; идентифицирующими объектами — соответствующие носители идентификационных свойств (фрагменты ДНК, групповые и видовые антигены и т. д.), определяемые в биологическом материале (следах), происшедшем от искомого объекта.

Идентифицируемым объектом следует также считать генотип искомого объекта, а идентифицирующими объектами — генетические профили (ДНК-профили) и другие отображения идентифицируемого объекта, получаемые в ходе исследования биологического материала, происшедшего от искомого объекта.

Задачи генетической идентификации. Идентификация заключается в выделении единичного материального объекта из множества других объектов. Особенностью криминалистической идентификации является то, что существует или предполагается связь исследуемого объекта с событием преступления.

Судебно-медицинская экспертиза биологических объектов, с точки зрения теории криминалистической идентификации, решает две задачи. Одной из них является идентификация личности посредством установления индивидуального тождества сравниваемых объектов. При этом проводится сопоставление свойств объекта, происшедшего от устанавливаемого лица (например, по следам, обнаруженным на месте происшествия), со свойствами объекта, происшедшего от известного лица, предположительно являющегося устанавливаемым (подозреваемого или потерпевшего). Принцип отождествления соответствует тому, который описан в классическом учении о криминалистической идентификации.

Другой задачей является идентификация личности посредством установления родства. Несмотря на то, что непосредственно тождество объектов в этом случае не устанавливается, процесс отождествления имеет место и здесь: идентифицируется, отождествляется носитель генетических свойств, обусловленных конкретным, определяемым обстоятельствами дела характером родства. Например, отождествляется подозреваемый (или ответчик — в гражданском процессе) как отец конкретного ребенка. В ряде случаев задача установления родства может быть переформулирована и полностью соответствовать задаче установления тождества. Так, идентификация индивидуума по его останкам может сопровождаться экспертными выводами двоякого рода — отражающими возможность родства этого индивидуума с проходящими по делу лицами (родственниками пропавшего без вести лица) либо непосредственно отождествления погибшего и пропавшего без вести (множество возможных генотипов которого выводится на основании генотипов родственников)¹⁵.

Методы генетической идентификации. Несмотря на то, что в генетической идентификации используются методы самых разных наук — молекулярной и популяционной генетики, биохимии, математики, информатики и др., все они преломляются через призму решения криминалистических задач. При этом они претерпевают существенную трансформацию и преобразуются в специальные, криминалистические методы. На современном этапе решение идентификационных криминалистических задач немыслимо без использования молекулярно-генетических методов, о которых будет сказано ниже.

Таким образом, генетическая идентификация — это исследование генетических свойств сопоставляемых биологических объектов с целью разрешения вопроса об их тождестве или о генетическом родстве.

Генетическая идентификация как криминалистическое направление отличается исключительно высокой степенью разработанности. Признаками этого являются: 1) наличие фундаментальной научной основы; 2) разработка на основе криминалистики и частных методов других наук методик, специально предназначенных для исследования генетических свойств криминалистических объектов применительно к решению криминалистических задач; 3) широкомасштабная валидация методов на экспертном материале; 4) подтвержденная высокая надежность и воспроизводимость результатов экспертного исследования генетических свойств; 5) изученность и систематизация причин, в силу которых, при ненадлежащем применении методов, возможно получение недостоверных результатов исследования; 6) высочайшая чувствительность и специфичность методов; 7) достижение возможности исследования биологических объектов практически любой природы; 8) наличие высокотехнологичного инструментария; 9) достижение полной автоматизации ДНК-технологий; 10) унификация и стандартизация методик, оборудования, реагентов, причем это проведено в европейском, мировом масштабах; 11) разработка системы обеспечения и контроля качества экспертных исследований; 12) осуществление этапа интерпретации результатов на наиболее объективной основе — с использованием математических методов; 13) разработка системы вероятностных расчетов специально для криминалистических целей и охват математическими алгоритмами большинства актуальных для практики экспертных ситуаций; 14) представленность используемых в математических расчетах референтных данных огромными массивами информации, охватывающими популяции всего мира¹⁶.

Генетическая идентификация — комплексна и объемна, как по объектам, так и по методам. Она интегрирует, преобразуя, знания из целого ряда фундаментальных наук, с использованием которых на базисе криминалистики разрабатывается система теоретических положений и принципов данного криминалистического направления, а также арсенал специальных криминалистических методик¹⁷.

Открытие английским генетиком Алеком Джеффрисом метода идентификации личности по ДНК, результаты которого он изложил в статье «Индивидуально-специфичные “отпечатки пальцев” ДНК человека» в журнале Nature в 1985 году, впоследствии привело к тому, что процесс исследований, который позволяет определять личность погибших в случае предоставления биологических образцов близких родственников и идентифицировать лиц, оставивших следы на местах преступлений, назвали ДНК-фингерпринтом (от англ. finger — палец и print — печать, оттиск, отпечаток) или «ДНК-дактилоскопией».

ДНК-идентификация («генетическая дактилоскопия») — это система научных методов биологической идентификации индивидуумов (организмов) на основе уникальной последовательности нуклеотидов ДНК каждого живого существа (за исключением однояйцевых близнецов), своеобразного «генетического отпечатка», остающегося индивидуальным и неизменным на протяжении всей жизни индивидуума (организма).

«ДНК-дактилоскопия» является современным молекулярно-генетическим направлением в определении индивидуальности личности, научную основу которого составляет генетическая идентификация.

В качестве непосредственного объекта исследований в «ДНК-дактилоскопии» используются гены, сочетание аллельных вариантов которых формирует уникальный набор, характерный для конкретной личности.

Известно, что 99,9% нуклеотидной последовательности ДНК человека совпадает по составу, однако 0,1% вполне достаточно, чтобы выявить генетическую уникальность ДНК разных людей.

§ 2. Строение, свойства ДНК и ее значение для криминалистической идентификации личности

Изучение теоретических основ ДНК-идентификации целесообразно начать с характеристики нуклеиновых кислот, которые играют ведущую роль в хранении и передаче наследственной информации потомкам, а также ее реализации в ходе индивидуального развития каждого организма.

Нуклеиновые кислоты (от лат. nucleus — «ядро») — это высокомолекулярные органические соединения, биополимеры (полинуклеотиды), образованные остатками нуклеотидов.

Ученые уже давно установили, что на Земле в каждом живом организме присутствуют два типа нуклеиновых кислот: рибонуклеиновая кислота (РНК) и дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК). ДНК и РНК состоят из мономерных единиц — нуклеотидов, поэтому нуклеиновые кислоты часто называют полинуклеотидами.

ДНК — это макромолекула (одна из трех основных, две другие — РНК и белки), обеспечивающая хранение информации обо всех признаках организма, передачу этой информации из поколения в поколение и реализацию генетической программы развития и функционирования живых организмов. С химической точки зрения ДНК представляет собой сложное высокомолекулярное соединение, состоящее из последовательности химически связанных между собой нуклеотидов.

Каждый нуклеотид включает в себя:

1) азотистое основание, состоящее из атомов углерода и азота;

2) пятиуглеродное сахарное кольцо (дезоксирибозу);

3) остаток фосфорной кислоты или фосфатную группу.

Азотистые основания — органические соединения, которые делятся на два типа: пуриновые и пиримидиновые. Пурины имеют по два конденсированных кольца: одно — пятичленное, другое — шестичленное. Пиримидины состоят из одного шестичленного кольца.

В состав ДНК входят четыре азотистых основания: аденин, гуанин (тип — пуриновые), цитозин и тимин (тип — пиримидиновые). Эти основания обычно обозначаются их начальными буквами: A, G, Т и С.

Азотистые основания соединены с дезоксирибозой (сахаром) гликозидной связью, которая в случае пиримидинового основания образуется между первым атомом пентозного кольца и третьим атомом основания, а в случае пуринового основания — между первым атомом пентозного кольца и девятым атомом основания. Данное соединение (т. е. соединение, состоящее из азотистого основания и сахара) называется нуклеозидом.

Фосфатные группы — неотъемлемые части ДНК, которые располагаются с внешней стороны спирали, имеют отрицательный заряд и требуют нейтрализации ионами металлов или положительно заряженными белками.

Соединение нуклеозида с остатком фосфорной кислоты называется нуклеотидом. Особенность этих соединений в том, что связи между фосфатными группами являются высокоэнергетическими, т. е. при их разрыве освобождается значительное количество энергии, которая может быть использована для различных клеточных процессов. Кроме того, нуклеозидтрифосфаты (сокращенно обозначаемые как dNTP) являются соединениями, из которых и синтезируется ДНК.

Азотистые основания имеют плоскую форму и располагаются парами перпендикулярно оси спирали. Каждое основание на одной из цепей связывается с одним определенным основанием на второй цепи. Такое специфическое связывание называется комплементарным. Пурины комплементарны пиримидинам (то есть способны к образованию водородных связей с ними): аденин образует связи только с тимином (А-Т), а цитозин только с гуанином (C-G).

Принцип комплементарного спаривания азотистых оснований определяет особую пространственную структуру молекулы ДНК. За счет образования водородных связей две полинуклеотидные цепи закручиваются относительно друг друга, формируя двойную спираль диаметром около 2 нм. При этом диаметр спирали остается одинаковым на всем протяжении молекулы. Один виток спирали имеет длину 3,4 нм и содержит 10 пар нуклеотидов. Следовательно, линейная длина одной нуклеотидной пары составляет 0,34 нм. Чередующиеся остатки дезоксирибозы и фосфорной кислоты образуют сахарофосфатный остов, расположенный на периферии молекулы ДНК, а азотистые основания находятся внутри спирали.

ДНК является макромолекулой. Но какова же ее длина? В любой клетке человека есть 23 пары хромосом, в каждой из которых содержится от 1,7 до 8,5 см ДНК. Если вытянуть ДНК всех хромосом в цепочку, то ее длина составит около 1,74 м. Возникает вопрос: каким образом такая длинная молекула может поместиться в ядро клетки живого организма?

У млекопитающих диаметр ядра клетки составляет примерно 6 мкм. Для того чтобы молекула ДНК поместилась в ядро клетки, она проходит процесс «упаковки», называемый «уровнями организации». ДНК имеет четыре таких уровня (структуры).

Рис. 3. Строение молекулы ДНК¹⁸

Первичная структура представлена цепочкой нуклеотидов, последовательность которых строго соблюдается для каждого отдельного организма, и которые связаны между собой фосфодиэфирными связями, т. е. нуклеотиды образуют цепь, остов которой состоит из чередующихся остатков дезоксирибозы и фосфорной кислоты, соединенных фосфодиэфирной связью.

Вторичная структура молекулы ДНК представляет собой спиралевидную структуру, состоящую из двух цепей последовательно связанных нуклеотидов. Модель вторичной структуры, которая и по сей день является общепризнанной, и была предложена в 1953 году учеными Уотсоном и Криком.

К основным характеристикам вторичной структуры относится следующее:

— состав каждой цепи ДНК строго специфичен для вида;

— связь между цепями водородная, образуется по принципу комплементарности азотистых оснований;

— полинуклеотидные цепи обвивают друг друга, образуя правозакрученную спираль, которая называется «хеликс»;

— остатки фосфорной кислоты располагаются снаружи спирали, азотистые основания — внутри.

Третичная структура ДНК — это ее суперспирализация. То есть мало того, что в молекуле две цепочки скручиваются друг с другом, как две нитки, но для еще большей компактности ДНК наматывается на специальные белки — гистоны, как на катушки для нитей.

Самый последний уровень организации ДНК — хромосома. Каждая молекула ДНК упакована в отдельную хромосому. Таким образом, ДНК упакована в ядре клетки, диаметр которого в миллионы раз меньше ее. Чтобы понять, насколько плотно в хромосоме уложена носительница генетической информации, можно представить следующее: если бы Эйфелева башня прошла все этапы компактизации, как и ДНК, ее можно было бы поместить в спичечный коробок.

Рис. 4. Процесс «упаковки» ДНК в хромосому¹⁹

Рибонуклеиновая кислота, в отличие от ДНК, это однонитевой биополимер, в качестве мономеров которого также выступают нуклеотиды. РНК играют важную роль в кодировании, прочтении, регуляции и выражении генов. Все клеточные организмы используют РНК для программирования синтеза белков, при этом матрицей для синтеза новых молекул РНК являются молекулы дезоксирибонуклеиновой кислоты.

Рибонуклеиновая кислота напоминает по своему строению одну цепь ДНК. Нуклеотидами, входящими в ее состав, являются гуанин, аденин, цитозин и урацил.

В отличие от молекулы ДНК, в качестве углеводного компонента рибонуклеиновой кислоты выступает не дезоксирибоза, а рибоза. Вторым существенным отличием в химическом строении РНК от ДНК является отсутствие в молекуле рибонуклеиновой кислоты такого нуклеотида, как тимин, — в РНК он заменен на урацил.

Функции РНК, которые они осуществляют в организме, различаются в зависимости от вида рибонуклеиновой кислоты. В клетках присутствуют три типа таких кислот: матричные РНК (мРНК), рибосомальные РНК (рРНК) и транспортные РНК (тРНК). Их различают по первичной структуре, молекулярной массе, конформации, продолжительности жизни и, самое главное, по функциональной активности.

Матричные РНК (мРНК) располагаются как в ядре, так и в цитоплазме клетки. Основное их назначение — перенос информации о строении белка от дезоксирибонуклеиновой кислоты к рибосомам, где и происходит сбор белковой молекулы.

Рибосомная РНК (рРНК) — самый распространенный вид РНК (около 90% от всех молекул данного вида в клетке). РРНК расположена в рибосомах и является матрицей для синтеза белковых молекул. Она имеет наибольшие, по сравнению с другими видами РНК, размеры.

Транспортная РНК (тРНК) расположена преимущественно в цитоплазме клетки. Основное ее назначение — осуществление транспорта (переноса) аминокислот к месту синтеза белка (в рибосомы). Транспортная РНК составляет до 10% от всех молекул РНК, располагающихся в клетке, и имеет наименьшие, по сравнению с другими РНК-молекулами, размеры (до 100 нуклеотидов).

Таблица 1

Сравнительная характеристика ДНК и РНК

Признаки | ДНК | РНК
Местонахождение в клетке | Ядро, митохондрии, хлоропласты | Ядро, рибосомы, цитоплазмы, митохондрии, хлоропласты
Местонахождение в ядре | Хромосомы | Ядрышко
Строение макромолекулы | Двойной неразветвленный линейный полимер, свернутый правозакрученной спиралью | Одинарная полинуклеотидная цепочка
Мономеры | Дезоксирибонуклеотиды | Рибонуклеотиды
Состав нуклеотида | Азотистое основание (пуриновое — аденин, гуанин; пиримидиновое — тимин, цитозин); дезоксирибоза (углевод); остаток фосфорной кислоты | Азотистое основание (пуриновое — аденин, гуанин; пиримидиновое — урацил, цитозин); рибоза (углевод); остаток фосфорной кислоты
Типы нуклеотидов | Адениловый (А), гуаниловый (Г), тимидиловый (Т), цитидиловый (Ц) | Адениловый (А), гуаниловый (Г), уридиловый (У), цитидиловый (Ц)
Свойства | Способная к самоудвоению по принципу комплементарности А = Т, Т = А, Г = Ц, Ц= Г. Стабильна | Не способна к самоудвоению. Лабильна
Функции | Химическая основа хромосомного генетического материала (гена); синтез ДНК, синтез РНК, информация о структуре белков | Матричная (мРНК) передает код наследственной информации о первичной структуре белковой молекулы; рибосомальная (рРНК) входит в состав рибосом; транспортная (тРНК) переносит аминокислоты к рибосомам

Процессы взаимодействия молекул ДНК и РНК в живом организме являются центральной догмой молекулярной биологии, сформулированной в середине ХХ века ученым Ф. Криком. Ее суть можно объяснить на простом примере по аналогии.

Общеизвестно, что белки являются строительным материалом любого живого организма и состоят из аминокислот, соединенных в цепочку пептидной связью. Аминокислотный состав белков определяется генетическим кодом, то есть ДНК. Допустим, нам необходимо построить жилой дом. Для его успешного строительства, прежде всего, понадобятся: а) строительный материал (кирпичи, окна, двери и пр.); б) рабочие, которые будут этот материал производить, доставлять к месту строительства, а также строить дом; в) план постройки дома. Как и при строительстве дома, в любом живом организме строительный материал — это белки, рабочие — молекулы РНК, синтезирующие белки и осуществляющие их доставку к месту назначения согласно плану строительства — генетическому коду, записанному в молекуле ДНК.

ДНК каждого человека неповторима. Макромолекула в своей структуре насчитывает около 3 млрд нуклеотидов. Сравните, к примеру, с любым алфавитом — сколько из букв можно составить слов? А теперь представьте, сколько разных молекул ДНК можно создать из 3 млрд составных элементов. Вероятность совпадения генотипа при условии исследования 10–15 систем — около 10–20. Даже суммарного количества людей за все время существования человечества недостаточно для того, чтобы говорить о возможном совпадении ДНК у двух индивидуумов. Все это позволяет делать вывод о возможности криминалистической идентификации личности с высокой степенью точности.

Каждая клетка содержит всю необходимую для развития и существования организма информацию. Хранятся эти сведения в генах — небольших участках ДНК, отвечающих за формирование единичного признака. Совокупность всех генов организма называют геномом.

Человек при зачатии наделяется двумя собственными цепочками ДНК, по одной от отца и от матери, и приобретает свой специфический геном. Все люди на Земле имеют одинаковое количество генов. В ходе реализации проекта «Геном человека» была определена последовательность ДНК всех хромосом и митохондриальной ДНК. Полное секвенирование (т. е. установление последовательности нуклеотидов в молекуле ДНК) выявило, что человеческий геном содержит около 20 тыс. активных генов. Тем не менее все мы разные. Это обусловлено различиями в структуре генов каждого человека, что и определяет нашу индивидуальность. Именно поэтому каждый человек имеет характерные только для него особенности организма: черты внешности, особенности обмена веществ, усвоения пищи и медикаментов, реакцию на факторы окружающей среды, стрессы, физические нагрузки и т. д. Феномен существования разных вариаций генов в ДНК называется полиморфизмом (poly — «много», morpho — «форма»).

ДНК-идентификация представляет собой процесс установления генетической индивидуальности любого организма на основе анализа его молекулы ДНК. Получаемый при этом «профиль» ДНК, как и отпечатки пальцев, может использоваться для отождествления личности. Именно по этой причине современные методы ДНК-анализа, используемые в целях криминалистической идентификации личности, и называют «ДНК-дактилоскопия» или «геномная дактилоскопия».

В основе ДНК-идентификации (типирования) лежат две характеристики ДНК как носителя генетической информации: 1) последовательность составляющих ее элементов (нуклеотидов) имеет индивидуальные особенности у каждого отдельного животного или растения, кроме идентичных (однояйцевых) близнецов или клонированных организмов; 2) у каждой особи ДНК всех соматических клеток (клеток тела) совершенно одинакова.

На протяжении двух последних десятилетий метод ДНК-идентификации все чаще используется в криминалистическом анализе и сегодня является неотъемлемой частью процесса расследования преступлений. Благодаря постоянному развитию технологии ДНК-анализа, типирование ДНК осуществляется с такой скоростью и точностью, что и количественные, и качественные результаты такого анализа ежедневно используются в процессе доказывания по уголовным делам.

Для ДНК-идентификации можно использовать любой биологический материал из живого или мертвого организма (например, кровь, сперму, слюну, корни волос, кожу и пр.). Важно только одно условие: чтобы ДНК в этих биологических веществах не была разрушена. На практике при проведении генетического типирования с целью идентификации личности или установления степени генетического родства (близости или отдаленности) сравнивают профили ДНК из нескольких биологических образцов и оценивают полученный результат, используя вероятностный и статистический анализ.

Идентификация личности по объектам биологического происхождения в последние годы приобрела особую остроту. Прежде всего, это связано с ростом числа тяжких преступлений против жизни, здоровья и половой неприкосновенности личности, а также увеличением количества неидентифицированных останков пропавших без вести и военнослужащих, участвовавших в вооруженных конфликтах. Тяжкие преступления, как правило, хорошо спланированы и организованы — на месте происшествия злоумышленники все реже оставляют отпечатки пальцев, следы обуви и тому подобное. Тем не менее современные средства позволяют обнаруживать там невидимые глазом микроследы, в том числе биологические. Установление лица по биологическим следам занимает центральное место в методике расследования преступлений, а ДНК-анализ — один из основных методов исследования в таких ситуациях.

Результаты судебных экспертиз с применением ДНК-анализа могут ориентировать следователя в поисковой деятельности, направленной на установление лица, совершившего преступление. Во многих случаях этому способствует экспертная инициатива. Как показывает практика, эксперты-криминалисты по результатам проведенных исследований нередко помогают следствию определить возможные варианты совершения преступления.

Пример. В Нижнем Новгороде была совершена серия изнасилований и были убиты две женщины. Результаты проведенных судебных экспертиз показали, что изъятые с мест происшествий следы ДНК совпадают. Некоторое время спустя на исследование поступил образец крови одного из подозреваемых. Эксперты обнаружили, что профиль ДНК-следов и образца крови подозреваемого частично совпадают, как если бы проверяемый являлся родственником лица, оставившего следы биологического происхождения на месте преступления. Об этом был проинформирован следователь.

В ходе проведения проверочных мероприятий выяснилось, что у подозреваемого есть родной брат. По результатам исследования сравнительных образцов была установлена его причастность к совершению всех перечисленных преступлений.

До внедрения в экспертную практику ДНК-анализа вопрос о том, принадлежит ли биологический след тому или иному лицу, решался с помощью исследования ряда белковых, ферментных и других систем, проводимого в рамках судебно-биологической или судебно-медицинской экспертизы вещественных доказательств. Однако устанавливаемые таким образом признаки носили групповой характер. Например, одна и та же группа крови свойственна огромному количеству людей. Поэтому основанные на таких исследованиях выводы не позволяли однозначно идентифицировать человека. Возможности же исследования ДНК уникальны. Во-первых, ДНК всех без исключения клеток, органов и тканей одного организма одинакова. То есть ДНК клеток крови конкретного человека идентична ДНК клеток его слюны или волос. Во-вторых, ДНК — это устойчивое химическое соединение, которое не изменяется на протяжении всей жизни (ее мутаций не происходит). Это позволяет использовать для анализов «пятна» любого возраста. В-третьих, ДНК обладает способностью «самовоспроизводиться». Теоретически генетическую информацию о человеке можно получить даже из одной клетки. И наконец, свойства ДНК передаются по наследству, что используется при установлении отцовства, а также случаев подмены детей.

Ребенок получает часть наследственных признаков, закодированных в 23 парах хромосом (от матери и от отца). Каждая хромосома — это и есть исследуемая нитка ДНК, которая упакована соответствующим образом. Макромолекула, как структурная единица, у всех одинаковая, а индивидуальность каждого человека обеспечена только комбинацией ее фрагментов (аллелей). Эти фрагменты находятся в строго определенном участке ДНК — локусе. Поэтому у ребенка в каждый участок (локус) попадет один фрагмент (аллель) от матери, а один от отца. Таким образом, когда говорят, что проводят исследование ДНК для установления отцовства, то имеют в виду, что у ребенка определяют наличие фрагментов (аллелей) в определенных участках (локусах), а потом смотрят, есть ли эти фрагменты у матери и предполагаемого отца.

Что же касается процесса расследования преступного деяния, то каждое совпадение преступника и преступления в базе данных ДНК — это тот случай, который следователь может быстро отнести к разряду «раскрытых». Быстрое раскрытие преступлений, в свою очередь, позволяет ему сконцентрировать внимание на других нераскрытых делах.

И последнее, но не менее важное преимущество — это гарантия того, что именно тот человек, который совершил преступление, предстал перед судом. В США, к примеру, в свое время анализ ДНК после вынесения приговора сыграл важную роль в освобождении свыше 100 невинно осужденных людей. В настоящее время все чаще анализ ДНК используется для снятия обвинения с человека до вынесения приговора.

По оценкам западных криминалистических лабораторий, при сравнении образца ДНК с места преступления с образцом ДНК от известного потенциального подозреваемого генетический анализ позволяет освободить подозреваемого в 1/3 всех криминальных случаев. Вывод о непричастности лица до вынесения приговора не только имеет огромное значение для человека, который ошибочно считается подозреваемым в совершении преступления, но и позволяет правоохранительным органам начать действовать в другом направлении и избежать потери времени на проведение следственных действий и оперативно-розыскных мероприятий. Кроме прямой пользы для обвиняемого и следователей такие случаи повышают уровень доверия людей к системе уголовного правосудия.

Таким образом, сегодня ДНК-анализ имеет огромное значение для криминалистической идентификации личности, и его возможности в недалеком будущем будут все более активно применяться в практической деятельности по расследованию преступлений. Идентификация личности с использованием методов «ДНК-дактилоскопии» стала возможна благодаря специфическим свойствам молекулы ДНК, к которым можно отнести:

1. Уникальность ДНК. Каждый человек в мире генетически индивидуален (кроме, как упоминалось выше, однояйцевых близнецов, которые, по сути, являются клонами).

2. Генетическое постоянство организма. Генетическая информация, в отличие от состава белков или жиров, не изменяется в течение жизни, а также в зависимости от типа клеток, из которых была выделена ДНК.

3. Чувствительность метода. Для современных методов ДНК-анализа достаточно даже нескольких капель крови или образца слюны, которой наклеивалась почтовая марка на конверт, или пятна спермы, по площади в 10 раз меньше булавочной головки, или ДНК, оставшейся на выкуренной сигарете.

4. Относительная стабильность молекул ДНК. В отличие от белков, являющихся нестабильными структурами, молекула ДНК обладает повышенной устойчивостью к воздействиям окружающей среды. Это свойство ДНК является для криминалистов ценным, поскольку позволяет проводить идентификацию даже по истечении большого срока давности, или же если останки человека не могут быть опознаны никакими другими методами (например, в случае совершения террористических актов или авиакатастроф)²⁰.

§ 3. Методы ДНК-профилирования

ДНК-профилирование (ДНК-типирование) — это процесс, основанный на методах исследования генетического материала (ДНК), направленный на выявление и оценку индивидуальных генетических особенностей биологического объекта, результатом которого является создание уникального ДНК-профиля человека.

В процессе расследования преступлений, когда в качестве вещественных доказательств по уголовным делам выступают вещества биологического происхождения и имеется возможность выделить из них макромолекулу, необходимо создать профиль ДНК.

ДНК-профиль — это уникальный набор аллельных вариантов генов, индивидуальный для каждого человека.

Нуклеотидные замены в ДНК (их называют также ДНК-полиморфизмами, или мутациями) делают нас индивидуально различными. Причем эти отличия могут быть найдены как в ядерных, так и в митохондриальных ДНК. Следует отметить, что ДНК-полиморфизмы можно обнаружить в геноме каждого человека — именно они становятся нашим неповторимым «ДНК-штрих-кодом». На существовании различий в структуре ДНК у разных индивидуумов и основаны современные методы ДНК-идентификации.

В формировании наборов аллельных вариантов генов, обладающих структурным полиморфизмом, главную роль играют относительно короткие нуклеотидные последовательности, получившие название минисателлитные и микросателлитные ДНК, состоящие из 8–70 и 3–7 пар нуклеотидов соответственно. Эти последовательности рассеяны по геному в виде блоков (локусов) и имеют тандемную организацию (многократно следуют друг за другом). Число тандемных повторов (и, следовательно, длина самих локусов) варьирует в пределах от 2–4 до нескольких тысяч. Наличие повторяющихся элементов в таких гомологичных сателлитных блоках и обусловливает структурный полиморфизм этих локусов.

В целях создания ДНК-профиля человека в процессе профилирования анализируется количество повторяющихся элементов (тандемных повторов) в выбранном участке генома. Чем больше участков генома (или локусов) анализируется при составлении ДНК-профиля, тем выше точность идентификации личности. В настоящее время число локусов для составления ДНК-профиля достигает 16 и более.

Рис. 5. ДНК-профиль человека²¹

Процесс ДНК-профилирования состоит из следующих этапов:

1) сбор биологического материала;

2) выделение из биологического материала ДНК и ее очистка;

3) проведение генетического анализа.

Сбор, выделение ДНК из биологического материала и очистка ДНК

Процедура выделения ДНК из клеток и тканей является исходным этапом в исследовании живого организма на молекулярном уровне. Для выделения ДНК человека могут использоваться любые биологические ткани: костные останки, зубы, волосяные луковицы, кровь, эпителиальные клетки, пот, слюна, образцы спермы, экскременты и т. д.

Биоматериал на вещественных доказательствах может сохраняться десятилетиями. Зачастую для исследования эксперт отбирает только часть материала — столько, сколько ему нужно для выделения ДНК. Например, при наличии на ноже следов крови эксперт не смывает всю кровь, а делает небольшой смыв непосредственно перед выделением ДНК. При этом на ноже остаются следы, по которым через несколько десятков лет удается провести повторную экспертизу²².

В клеточном ядре ДНК находится в тесном контакте с многочисленными органическими молекулами, необходимыми для ее эффективного функционирования. Однако для проведения генетического анализа из исследуемого образца должны быть удалены углеводы, липиды и белки, которые могут снижать эффективность применяемых методов и, как следствие, влиять на раскрываемость преступлений.

Для выделения ДНК клетку необходимо разрушить тем или иным способом, а ДНК, соответственно, очистить от других клеточных компонентов. При этом важно защитить ДНК от действия нуклеаз (ферментов, гидролизующих фосфодиэфирную связь между субъединицами нуклеиновых кислот) и максимально сохранить ее целостность, поскольку длинные линейные молекулы ДНК при их изоляции из клетки неизбежно фрагментируются.

Выделение ДНК из клетки обычно включает в себя следующие этапы: 1) лизис клеток (разрушение мембраны клеток); 2) ферментативное разрушение белков протеиназами; 3) отделение ДНК от примесей (центрифугирование для удаления денатурированных белков и фрагментов клеточных органелл).

Рис. 6. Процесс выделения ДНК²³

Для лизиса клеток и денатурации белков часто используется детергент додецилсульфат натрия или хаотропный агент гуанидин изотиоцианат.

Если нет необходимости в длинных целых фрагментах ДНК, клетки можно разрушить механическим способом путем перетирания со стеклом или речным песком в жидком азоте. Ряд современных методов предусматривает сорбцию ДНК на гранулах силикагеля в присутствии хаотропных веществ, центрифугирование и последующую элюцию ДНК с гранул в раствор.

Наиболее распространенным универсальным неорганическим методом, пригодным для экспертного применения, является метод с использованием хелатирующего реагента Chelex 100. Это экспресс-метод, который вообще не предполагает выделения ДНК в очищенном виде; получаемый препарат, по сути, представляет собой клеточный лизат, который содержит все исходные компоненты, только в инактивированной форме. Данный метод прост и не требует много времени, однако следует учитывать, что его надежность, а также качество и стабильность «килексных» препаратов в целом заметно ниже, чем фенол-хлороформных экстрактов.

Так называемый фенольный метод является универсальным. При его использовании происходит процесс наиболее полного очищения от белков и различных клеточных компонентов. К положительным сторонам данного метода относится то, что в итоге получают ДНК достаточно высокой степени очистки, пригодную для длительного хранения. К недостаткам метода можно отнести необходимость применения высокотоксичных реактивов, в результате чего появляется потенциальная вероятность потери части ДНК, содержащейся в представленном на исследование объекте.

Очень важный в экспертной практике частный случай — это выделение ДНК из спермы и смешанных следов, содержащих сперму. Особенность здесь состоит в том, что хроматин сперматозоидов имеет принципиальное отличие от хроматина соматических клеток — его структура дополнительно стабилизирована дисульфидными связями. Поэтому применяемый по стандартной процедуре выделения ДНК протеолиз в случае спермального хроматина малоэффективен и идет очень медленно, а используемые для диссоциации нуклеопротеинов детергенты практически не оказывают на него солюбилизирующего действия. В результате выход спермальной ДНК оказывается практически нулевым. Для преодоления этой трудности при выделении ДНК из спермы в клеточный лизат вводят дополнительно реагенты-восстановители, например дитиотреитол или 2-меркаптоэтанол, которые разрушают дисульфидные белковые сшивки. Это позволяет продолжить процесс по стандартной схеме.

После проведения процедуры выделения ДНК осаждают из раствора этанолом и после центрифугирования растворяют осадок в буферном растворе. Вместе с ДНК частично выделяется и РНК, от которой избавляются с помощью фермента РНКазы.

В настоящее время выделение ДНК занимает немного времени благодаря разнообразным коммерческим наборам и системам, специально разработанным для экстракции нуклеиновых кислот от ведущих мировых (QIAGEN, Bio-Rad) и российских (БиоЛабМикс, Lumiprobe, Biomedial Innovations, ЕВРОГЕН) производителей.

В крупных криминалистических центрах с тысячами анализов в день процесс выделения и очистки ДНК полностью автоматизирован. Роботизированные системы получили широкое применение, позволяя ускорить процесс, снизить себестоимость работ и значительно снизить вероятность ошибки.

После экстракции ДНК растворяют в специальном составе, где при необходимости она может храниться в течение многих лет (при температуре –20 °C или –80 °C).

При наличии выделенной ДНК далее становятся возможными ее амплификация с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), определение последовательности (секвенирование), рестрикционный анализ, клонирование, гибридизация.

Проведение генетического анализа

Сразу после экстракции ДНК перед специалистом встает вопрос о дальнейших путях ее анализа. С момента внедрения ДНК-идентификации в криминалистику методы молекулярной биологии изменились настолько, что в настоящее время существует сразу несколько возможных их вариантов (методов). У каждого из них есть свои достоинства и недостатки. Общим для всех методов ДНК-идентификации является исследование особых, так называемых гипервариабельных участков геномной ДНК человека, которые строго специфичны для каждого индивидуума и потому могут служить индивидуализирующими личность признаками.

Выбор конкретного метода зависит от решаемого вопроса, доступного количества ДНК, возможностей ее очистки, а также времени, доступного для проведения анализа.

ПДРФ-анализ

Анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ, англ. Restriction fragment length polymorphism, RFLP) — исторически один из первых методов в «ДНК-дактилоскопии». Данный метод основан на использовании в исследовании специальных клеточных ферментов — рестриктаз.

Эндонуклеазы рестрикции, или рестриктазы (от лат. restrictio — ограничение), — это группа ферментов, относящихся к классу гидролаз, катализирующих реакцию гидролиза нуклеиновых кислот. К настоящему времени описано несколько тысяч подобных ферментов.

Рестриктазы способны специфически распознавать участки ДНК. При этом каждая рестриктаза узнает определенный участок ДНК длиной от четырех пар нуклеотидов и расщепляет (разрезает) нуклеотидную цепь внутри участка узнавания или вне его. После разрезания молекулы ДНК рестриктазами специалист проводит оценку длин полученных фрагментов с использованием гель-электрофореза (электрофорез ДНК).

Рис. 7. Исследование ДНК методом ПДРФ-анализа²⁴

Электрофорез ДНК — это аналитический метод, применяемый для разделения фрагментов ДНК по длине. Он основан на разной скорости движения фрагментов разной длины под действием внешнего электрического поля.

Рис. 8. Электрофорез ДНК²⁵

Физический принцип метода заключается в следующем. Находящиеся в буферном растворе макромолекулы обладают некоторым суммарным электрическим зарядом. Если через раствор, заключенный в канал из изолирующего материала, начать пропускать электрический ток, то вдоль канала сформируется электрическое поле. Под действием поля макромолекулы в соответствии со своим суммарным зарядом мигрируют в направлении катода или анода. В зависимости от величины заряда и размеров молекулы приобретают различные скорости. Постепенно исходный препарат, состоящий из различных молекул, разделяется на зоны одинаковых молекул, мигрирующих с одинаковой скоростью.

В современных приборах рабочий канал заполняют гелем, наличие сетки которого вносит важную дополнительную деталь в электрофоретическую миграцию молекул. Фракционируемые молекулы сталкиваются с нитями полимера, образующими сетку геля, что увеличивает сетку геля и снижает скорость движения молекул. В настоящее время для проведения электрофореза ДНК используют полиакриламидный и агарозный гели.

В ходе электрофореза зоны макромолекул остаются невидимыми, поэтому перед началом электрофореза к образцам принято добавлять два разных красителя с кислым значением pH (как правило, используют ксиленовый голубой и бромфеноловый синий), чтобы визуализировать ход электрофореза. Например, агарозные гели обычно красят бромистым этидием, который флюоресцирует в УФ-лучах. Краситель также необходим для того, чтобы определить, когда стоит остановить процесс.

После разделения ДНК получаемый отпечаток геля на мембранном фильтре инкубируют в растворе, содержащем специально подобранные зонды — фрагменты ДНК, меченные радиоизотопом. Содержащие комплементарные зонду участки исследуемой ДНК связываются (гибридизуются) с ним и выявляются с помощью радиоавтографии. Таким образом, на радиочувствительной пленке в виде набора полос идентифицируются сразу все микро- и минисателлиты геномной ДНК, гомологичные используемому зонду. По аналогии с анализом дактилоскопического оттиска (рисунком папиллярных линий) и появился термин «генетическая, или геномная, дактилоскопия». Каждый индивидуум имеет свой геномный «отпечаток», который характеризуется определенным числом полос (до нескольких десятков), их расположением на дорожке и интенсивностью почернения каждой из полос. Чем больше родство, тем больше совпадений. Вся картина обнаруживает даже более высокую индивидуальную специфичность, чем папиллярные узоры, и поэтому может служить своеобразным «генетическим удостоверением» личности. У кровных родственников число совпадающих полос заметно больше, у близнецов они идентичны.

Рис. 9. Электрофореграмма ДНК²⁶

С помощью ПДРФ-анализа можно идентифицировать некоторые различия в последовательности нуклеотидов ДНК в случае, когда они располагаются в сайте рестрикции. Ввиду того, что технологии секвенирования ДНК могут охарактеризовать ДНК очень точно, ПДРФ-анализ был разработан как первый и дешевый метод для массового применения. Вместе с тем данный метод подразумевает фрагментацию ДНК, он очень чувствителен к качеству и количеству исходного генетического материала. Поэтому в настоящее время ПДРФ-анализ в криминалистике практически не используется, в отличие от других, более эффективных методов исследования ДНК.

ПЦР-анализ

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — метод молекулярной биологии, позволяющий добиться значительного увеличения малых концентраций определенных фрагментов ДНК путем создания их копий из исходного образца.

Данный метод основан на многократном избирательном копировании (амплификации) того или иного участка ДНК с помощью фермента ДНК-полимеразы в условиях in vitro²⁷.

Для проведения процедуры ПЦР специалисту необходимы следующие компоненты:

а) анализируемая ДНК (это может быть как отдельный фрагмент молекулы, так и плазмида или хромосома);

б) праймер — искусственно синтезированная короткая цепочка нуклеотидов (15–30 пар), комплементарная выбранному участку одной из цепей анализируемой ДНК;

в) ДНК-полимераза — фермент, строящий комплементарную матричной цепь ДНК (обычно используют термостабильные полимеразы, изначально выделенные из термофильных бактерий и архей);

г) смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов (дНТФ) — «строительный материал», используемый полимеразой для синтеза второй цепи ДНК;

д) буфер — раствор, содержащий различные ионы для поддержания нужного уровня рН, соли магния, необходимые для работы полимеразы, и неионный детергент для предотвращения налипания компонентов реакции на стенки пробирки.

После подбора необходимых для реакции компонентов их смешивают в нужном объеме деионизованной воды в специальных пробирках для ПЦР и помещают в амплификатор — прибор, обеспечивающий периодическое охлаждение и нагревание пробирок.

Рис. 10. Амплификатор для проведения ПЦР²⁸

Цель ПЦР — получить множество одинаковых двухцепочечных кусочков ДНК строго определенной длины (обычно не более 2–3 тысяч пар нуклеотидов). Для этого проводят 20–30 циклов реакции, каждый из которых состоит из трех этапов.

1 этап — денатурация. Чтобы полимераза могла работать, две цепи ДНК-матрицы необходимо разъединить. Для этого реакционную смесь нагревают до 94–98 °C. В таких условиях спираль ДНК раскручивается, разрушаются водородные связи между азотистыми основаниями параллельных цепей.

2 этап — отжиг праймеров. На этом этапе праймеры специфично присоединяются к освободившимся цепям ДНК-матрицы с разных сторон копируемого участка. Чтобы праймеры могли комплементарно связаться (отжечься) только с нужными участками, при их конструировании необходимо учитывать такую важную характеристику, как температура плавления. Это расчетная температура, при которой половина праймеров присоединяется к целевому участку ДНК. Отжиг проводят при температуре на 1–5 °C ниже температуры плавления, но не выше оптимальной температуры работы полимеразы, то есть в пределах 40–72 °C.

Чтобы разработать эффективные праймеры, необходимо знать последовательность ДНК у концов целевого участка и, руководствуясь упомянутыми критериями, выбрать подходящие фрагменты, которым будут комплементарны будущие праймеры.

3 этап — элонгация, или синтез ДНК. Данный этап чаще проводят при температуре 72 °C — оптимальной для работы полимеразы. Фермент присоединяется к комплексам праймер-матрица и, выхватывая из раствора нуклеотиды, начинает по принципу комплементарности присоединять их к 3ˊ концу праймера. Удлинение, или элонгация, новой цепи ДНК идет с максимальной скоростью — 50–60 нуклеотидов в секунду (то есть около 3000 в минуту). Однако при программировании амплификатора задают время с запасом: по минуте на каждую тысячу пар нуклеотидов.

Рис. 11. Полимеразная цепная реакция (ПЦР)²⁹

Праймеры оказываются встроенными в молекулы вновь синтезируемой ДНК, которые на следующем цикле ПЦР, в свою очередь, могут служить матрицами для синтеза комплементарной цепи. Таким образом, в каждом цикле должно происходить удвоение молекул ДНК, а многократное повторение циклов приводит к экспоненциальному накоплению продукта (увеличению количества копий ДНК). За 30 циклов количество синтезированного фрагмента может приблизиться к 1 млрд.

С изобретением метода полимеразной цепной реакции ДНК-профилирование сделало огромный шаг вперед как в отношении разрешающей способности, так и в возможности восстановления информации по очень малым (или деградирующим) образцам. ПЦР-анализ позволил исследовать даже незначительные количества ДНК, а также определять ДНК-профили для смеси образцов, таких, например, как вагинальный мазок у жертв сексуального насилия и пр.

ПДАФ-анализ

Разработка метода полимеразной цепной реакции позволила размножать (амплифицировать) любую последовательность ДНК, получать десятки и сотни миллионов ее копий и использовать для молекулярно-генетического анализа исчезающе малые количества биологического материала. Появилась возможность сравнивать длину отдельных локусов мини- и микросателлитных ДНК, не подвергая их предварительному ферментативному расщеплению, то есть осуществлять анализ полиморфизма длины амплифицированных фрагментов (ПДАФ-анализ).

Вариант молекулярно-генетического идентификационного анализа, в основе которого лежит феномен полиморфизма длины амплифицированных фрагментов ДНК, является одним из наиболее перспективных в плане судебно-медицинского исследования вещественных доказательств. Он отличается высокой дифференцирующей способностью — благодаря использованию в качестве маркерных (диагностических) элементов высокополиморфных генетических локусов мини- и микросателлитной природы, а также чрезвычайно высокой чувствительностью — благодаря применению полимеразной цепной реакции.

Феномен ПДАФ проявляется в том, что в случае ПЦР-амплификации гипервариабельных мини- и микросателлитных генетических матриц (локусов), присутствующих в геноме каждого человека, в ходе реакции образуются фрагменты ДНК, которые у разных людей имеют разную длину и потому оказываются индивидуально специфичными.

Амплифицируемые в ходе ПЦР мини- и микросателлитные участки (локусы) ДНК — это относительно короткие нуклеотидные последовательности, организованные в виде блоков тандемных повторов. Высокий уровень вариабельности (феномен гиперполиморфизма) микро- и минисателлитов основан на том, что число тандемных повторов, соединенных «голова к хвосту» в единую последовательность ДНК непостоянно и варьируется в разных аллелях данного локуса от одного до нескольких десятков. Таким образом, для данного локуса в популяции обнаруживается целый набор аллелей (феномен мультиаллельности), отличающихся друг от друга по числу повторяющихся единиц. У каждого индивидуума в популяции имеется из этого набора по 2 аллеля, и они могут быть равной или разной длины (соответственно, гомозиготное и гетерозиготное состояния). Такого рода генетические элементы получили название локусов с варьирующимся числом тандемных повторов или просто тандемных повторов с переменным числом звеньев.

В методическом плане важно отметить, что класс тандемных полиморфных локусов условно разбит на два подкласса: минисателлитов или VNTR (от англ. Variable Number Tandem Repeat) — с длиной повтора более семи пар нуклеотидов, и микросателлитов, у которых длина повторяющейся единицы составляет от трех до семи пар нуклеотидов и которые также называют короткими тандемными повторами, или STR (от англ. short tandem repeat). Эти две группы ПДАФ-систем, хотя и являются функциональными аналогами, не вполне эквивалентны по своим прикладным свойствам; в аспекте судебно-медицинской экспертизы их следует рассматривать как взаимодополняющие. Суть их особенностей состоит в следующем.

Рис. 12. Сравнительная длина коротких тандемных повторов в двух конкретных локусах³⁰

Минисателлитные системы в своем большинстве обладают гораздо более высоким полиморфизмом, чем микросателлитные. Соответственно, их дифференцирующие свойства также заметно выше. Однако существенные ограничения накладываются на ПДАФ-анализ минисателлитных локусов при исследовании деградированных препаратов ДНК, например выделенных из пятен крови, спермы, слюны, а также частей волосяного покрова и трупного материала, подвергшихся разложению под действием разрушающих биологических или физико-химических факторов. При анализе подобных препаратов может наблюдаться отсутствие электрофоретических полос в аллельном диапазоне, что, как правило, свидетельствует о деградации аллелей анализируемого локуса. Если же при анализе деградированного образца ДНК обнаруживается только один низкомолекулярный аллель, то в этом случае существует опасность ложной гомозиготности: возможно, анализируемый образец является гетерозиготным, но высокомолекулярный аллель не выявляется в ходе исследования, поскольку степень его деградации оказывается более высокой.

С этой точки зрения ПДАФ-типирование микросателлитных, STR-локусов может дать определенные преимущества. Так, благодаря более коротким, по сравнению с минисателлитными, размерам STR-аллелей в целом выше вероятность их сохранения в деградированной ДНК. На практике это означает ощутимый выигрыш в чувствительности анализа. Кроме того, вероятность ложной гомозиготности, обусловленной предпочтительной амплификацией низкомолекулярных аллелей, крайне низка для микросателлитных локусов вследствие узости спектра аллельных длин.

В настоящее время для экспертных целей разработано несколько десятков молекулярно-генетических ПДАФ-систем на основе мини- и микросателлитных полиморфных локусов. Следует иметь в виду, что в случае микросателлитов согласно международной практике для экспертного применения подходят только «крупные» — тетра- и пентануклеотидные STR.

Технологическая схема выполнения экспертизы вещественных доказательств с использованием ПДАФ-систем включает следующие этапы:

а) получение препаратов хромосомной ДНК из объектов исследования;

б) энзиматическая ПЦР-амплификация на матрице этой ДНК специфических участков, обладающих свойством ПДАФ, с целью их последующего генотипирования (определения геномных вариантов);

в) фрагментный анализ: фракционирование с помощью гель-электрофореза продуктов амплификации, сопоставление амплификационных профилей, определение молекулярных размеров фрагментов и их генотипирование;

г) интерпретация результатов: раздельная оценка выявленных геномных признаков и определение их индивидуализирующего значения, сопоставление и оценка различия и совпадения комплекса признаков, анализ всей совокупности экспертных данных с целью разрешения вопросов, поставленных перед экспертизой.

ПДАФ-типирование ДНК является одним из наиболее доказательных методов анализа биологического материала при производстве судебной молекулярно-генетической экспертизы. В то же время следует подчеркнуть, что экспертные исследования биологических объектов с использованием индивидуализирующих систем ПДАФ-типа предъявляют очень высокие требования как к техническому обеспечению анализа, так и к степени корректности экспериментальных процедур и интерпретационных построений. Наряду с бесспорными преимуществами по сравнению с традиционными методами, экспертное применение анализа ПДАФ в судебно-медицинской практике сопряжено с целым рядом осложняющих моментов. Технология анализа включает многостадийные операции и многопараметрические процессы, которые таят в себе опасность различного рода артефактов. Интерпретация получаемых в ходе исследования данных часто достаточно сложна и требует детального анализа с позиции молекулярной биологии и популяционной генетики. Учитывая характерное для данного вида экспертизы высокое доказательственное значение выводов, возможная неадекватность экспериментальных процедур и неправильное истолкование результата чреваты серьезными экспертными и, как результат, судебно-следственными ошибками.

В настоящее время разработаны мультиплексные амплификационные системы, которые позволяют одновременно анализировать ПДАФ сразу нескольких локусов (их может быть более десяти). В этом случае амплификационный профиль ДНК, создаваемый уже суммой локусов, оказывается чрезвычайно полиморфным (является комбинацией нескольких независимых полиморфных элементов), что обеспечивает очень высокую достоверность анализа.

К сожалению, в целом анализ STR не идеален — он трудоемкий, дорогой и отнюдь не моментальный. В настоящее время существуют и другие технологии, исследующие различные геномные маркеры.

SNP-анализ

Кроме тандемных повторов при анализе ДНК используют так называемые однонуклеотидные полиморфизмы (англ. Single Nucleotide Polymorphism, SNP, произносится как «снип»).

Однонуклеотидный полиморфизм — это отличия последовательности ДНК размером в один нуклеотид (A, T, G или C) в геноме, то есть замены одного нуклеотида на другой, которые когда-то появились в результате мутаций, а потом распространились в популяциях человека. Современные методы анализа ДНК позволяют легко их выявлять, поэтому однонуклеотидный полиморфизм (наряду с полиморфизмом длин рестрикционных фрагментов (RFLP) и ПДАФ (AFLP)) широко используют в качестве молекулярно-генетических меток (маркеров). SNP есть и в ядерной ДНК, и в митохондриальной.

Рис. 13. Однонуклеотидный полиморфизм (SNP)³¹

Снипы представляют собой высокоинформативную систему для судебной ДНК-идентификации. Существует сразу несколько причин, по которым снипы имеют массу преимуществ перед STR-локусами:

— снипы — самый широко представленный тип геномного полиморфизма;

— снипы при амплификации с помощью ПЦР не дают так часто артефактов, как STR-локусы;

— снипы биаллельны, поэтому для них легче подсчитать частоты в популяциях;

— методы детекции снипов легче поддаются автоматизации;

— результаты по снипам легче оцифровываются.

Вместе с тем произведенные лабораторные сравнения дискриминирующих возможностей SNP-полиморфизма и STR-локусов оказались в пользу последних. Однако, несмотря на повсеместное применение победивших в конкурентной борьбе за ДНК-идентификацию личности STR-локусов и создание на их основе многочисленных коммерческих наборов, научный интерес к снипам как потенциальным маркерам полиморфизма ДНК человека продолжает оставаться высоким, поэтому криминалистическое направление в исследовании снипов полному забвению не подверглось. Как полагают специалисты, одной из причин использования снипов в криминалистической ДНК-идентификации является возможность детекции более коротких участков ДНК, которые с большей вероятностью сохраняются в старых биологических образцах и не могут быть выявлены с помощью STR-локусов.

Анализ митохондриальной ДНК

Наиболее разработанным методом