Коллектив авторов
Морфологическая диагностика. Подготовка материала для гистологического исследования и электронной микроскопии
ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ
БСА – бычий сывороточный альбимин
ГОФП – гематоксилин-основной фуксин-пикриновая кислота
ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота
РНК – рибонуклеиновая кислота
ОКГ – оранжевый, красный, голубой
СФУ – спирт-формалин-уксусная кислота
ШИК – шифф-йодная кислота
EDTA – этилендиаминтетрауксусная кислота
DDSA – додециловый ангидрид янтарной кислоты
DMP-30 – 3-диметиламинометилфенол
MNA – метиловый эфир надовой кислоты
PI – пропидия иодид
ПРЕДИСЛОВИЕ
Среди современных методов лабораторной и клинической диагностики морфологические методы по праву занимают одно из первых мест благодаря своей информативности и диагностическому значению. К ним относятся методы, применяемые при гистологической и цитологической диагностике в онкологии, гематологии, неврологии, патологической анатомии и судебной медицине, а также многочисленные методы лучевой диагностики, которые не рассматриваются в настоящей книге. В отдельных случаях точный диагноз не может быть установлен без использования ультраструктурного исследования (электронной микроскопии). Иногда может оказаться полезным и применение специальных методов микроскопии – поляризационной, флуоресцентной и конфокальной лазерной. Все эти морфологические методы используются и при проведении научных исследований для разработки адекватных биологических моделей заболеваний человека и создания новых лекарственных препаратов и технологий, предназначенных для лечения моделируемых заболеваний.
В связи с высокой информативностью и исключительной иллюстративностью морфологические методы исследования достаточно широко используются не только специалистами – гистологами и патологоанатомами, профессиональная подготовка которых предусматривает детальное изучение гистотехнологии и основ ультраструктурного исследования, но и врачами, а также научными работниками других специализаций. В этих случаях как у клиницистов, так и у научных работников иногда возникает необоснованное впечатление о простоте использования гистологических методов и легкости получения необходимой информации с их помощью. Тем не менее некоторые гистологические методы достаточно сложны даже для опытного специалиста-морфолога (современные методы электронной микроскопии, иммуноцитохимии, конфокальной лазерной микроскопии). Поэтому одной из главных задач настоящего руководства является ознакомление специалистов различных профилей с ключевым разделом гистологического и электронно-микроскопического исследования – пробоподготовкой. Без адекватной пробоподготовки невозможно получить содержательные результаты высокого качества, пригодные для диагностики и научных целей. Именно на этом этапе исследования делают большинство ошибок начинающие специалисты и формируется подавляющее большинство артефактов, способных ввести в заблуждение даже опытных аналитиков.
В представленном руководстве обобщен опыт ведущих отечественных и зарубежных специалистов в области гистологической техники и гистотехнологии. Многие из представленных протоколов в настоящее время используются при проведении исследований, выполняемых в лаборатории функциональной морфологии центральной и периферической нервной системы в Институте экспериментальной медицины (ИЭМ). Часть из приведенных в настоящем издании сведений отражает многолетний опыт ведущей отечественной гистологической школы, созданной Николаем Григорьевичем Хлопиным и Владимиром Павловичем Михайловым, который бережно сохраняли и передали своим коллегам сотрудники лаборатории экспериментальной гистологии ИЭМ. Данные, касающиеся подготовки материала для электронной микроскопии, представлены с учетом многообразного собственного опыта авторов соответствующего раздела и методических разработок сотрудников лаборатории цитологии ИЭМ, организованной профессором А. А. Маниной.
Авторы считают своим долгом поблагодарить всех, кто способствовал выходу в свет этой книги. Особо следует отметить неоценимую помощь лаборанта-исследователя Ларисы Николаевны Шатило при отработке и проверке методов заливки гистологического материала. В работе над отдельными текстами, вошедшими в настоящую книгу, принимал участие к. м. н. А. В. Гиляров. Протокол окраски головного мозга по методу Клювера – Баррера выверен сотрудницей физиологического отдела им. И. П. Павлова ИЭМ М. А. Шкляевой. В разработке метода одновременного селективного выявления эозинофильных гранулоцитов и тучных клеток дыхательных путей принимал участие аспирант Санкт-Петербургской химикофармацевтической академии П. А. Ворончихин. Рисунки выполнены И. С. Кирик.
Редактор руководства приносит сердечную благодарность своим учителям – доценту Людмиле Ростиславовне Сапожниковой, профессору Георгию Сильвестровичу Катинасу и члену-корреспонденту РАМН Владимиру Александровичу Отеллину.
Авторы надеются, что представленные в книге прописи и протоколы, а также сведения о производителях высококачественных реагентов, материалов и приборов для микроскопии и диагностики помогут всем, кто планирует использовать в своей повседневной работе и научных исследованиях современные методы гистологии, цитологии и электронной микроскопии.
Раздел I
ПОДГОТОВКА МАТЕРИАЛА ДЛЯ ГИСТОЛОГИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ
Глава 1
ФИКСАЦИЯ МАТЕРИАЛА ДЛЯ ГИСТОЛОГИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ
1.1. Общие положения
Фиксация – один из ключевых этапов гистологического исследования, от которого во многом зависит качество получаемого препарата. Фиксированный не по правилам или недофиксированный препарат, как правило, непригоден для микроскопического анализа, поэтому необходимо тщательно соблюдать правила фиксации и регулярно контролировать качество реагентов, используемых для приготовления фиксирующих растворов.
Фиксация обеспечивает стабилизацию и уплотнение тканевых структур. Выбор фиксирующей среды зависит от задач исследования. Объем фиксирующей жидкости должен превышать объем кусочков не менее чем в 10 раз. Кусочки в растворе не должны слипаться и скапливаться на дне банки. В большинстве случаев (если нет особых указаний) фиксацию следует проводить при комнатной температуре, поскольку охлаждение раствора ведет к замедлению процесса фиксации, а подогрев – к быстрому развитию аутолиза в центральной части фиксируемого объекта (той области, в которую не успел проникнуть фиксатор).
Важным моментом является правильное иссечение объектов, предназначенных для фиксации и дальнейшего гистологического исследования. Кусочки органов следует вырезать острым ножом или бритвой. Не рекомендуется пользоваться ножницами во избежание травмирования объектов. Нельзя сдавливать кусочки, скоблить или протирать их поверхность, особенно слизистую и серозную оболочки.
Для микроскопического исследования вырезают кусочки органов толщиной 0,5 – 1,0 см. Длина и ширина могут быть различными (обычно 1,0 × 1,5 см). При этом стараются сформировать объект с таким расчетом, чтобы получаемый срез поместился на стандартное предметное стекло. Ввиду медленного проникновения фиксатора в глубину ткани не рекомендуется брать для исследования более толстые кусочки. Кусочки сразу же помещают в фиксирующую жидкость. Недопустимо обмывание кусочков водой перед фиксацией (это может привести к удалению объектов, имеющих диагностическое значение, и появлению артефактов).
1.2. Фиксация материала для световой микроскопии
Световая микроскопия – микроскопия в проходящем свете видимого спектрального диапазона с использованием способности различных компонентов гистологического препарата к селективному восприятию биологических красителей. Для того чтобы структуры, наблюдаемые в микроскоп, хорошо сохранялись при обработке иссеченного материала, необходимо сделать их устойчивыми к действию применяемых при проводке и окраске химических реагентов. Подобная устойчивость структур, а также уплотнение материала достигаются в ходе фиксации. Фиксация необходима и для максимального сохранения внутриклеточных и тканевых взаимоотношений, только при этом условии можно получить информативные препараты для диагностических и исследовательских целей.
Существуют физические и химические способы фиксации. К первым относятся действие высокой температуры и влияние электромагнитного излучения в сверхвысокочастотном диапазоне (микроволновая фиксация). В настоящее время высокотемпературная фиксация применяется редко. По С. С. Вайлю, кусочки нефиксированной ткани помещают в кипящую воду на 1 – 3 мин, после чего переносят в 90 – 100 %-й этанол и после обезвоживания заливают в парафин. Р. Лилли (1969) рекомендует использовать для варки изотонический раствор хлорида натрия (0,85 – 0,90 %) и изготавливать срезы на замораживающем микротоме без заливки. В этом случае препарат можно получить через несколько минут после доставки срочной биопсии. К возникающим артефактам относят сильное сморщивание тканей и разрушение нежных структурных образований (Вайль С. С., 1934).
Микроволновая фиксация осуществляется при помощи современных лабораторных установок, позволяющих контролировать температуру обрабатываемого объекта. Преимущество этого метода перед другими способами фиксации состоит в мгновенном проникновении фиксирующего фактора во все части объекта. Экспериментальными исследованиями установлено, что оптимальная температура при микроволновой фиксации составляет 45 – 55 °C. Перегрев объекта до температур выше 65 °C ведет к появлению артефактной вакуолизации цитоплазмы и пикнотизации ядер клеток. Данный метод фиксации рекомендован при проведении срочных биопсий (Bancroft J. D. [et al.], 2002).
Химические методы фиксации основаны на влиянии на тканевые структуры различных химических веществ (спиртов, альдегидов, кетонов, кислот, солей), которые, проникая в фиксируемый материал, вызывают многообразные физико-химические процессы, приводящие к стабилизации его структуры. Различают простые и сложные (составные) фиксаторы. К первым могут быть отнесены ацетон, этанол, метанол, формалин, тетраоксид осмия. Вторая группа намного более разнообразна и включает сотни различных составных фиксирующих растворов, обладающих различными преимуществами и недостатками.
1.2.1. Ацетон
Ацетон как самостоятельное фиксирующее вещество редко применяется в гистологии из-за сильного сжатия фиксируемого материала. Тем не менее его нередко используют для фиксации цитологических мазков и криостатных срезов, выполненных из нефиксированного материала. Считается, что кратковременная фиксация ацетоном (15 мин) позволяет сохранить часть антигенов, которые разрушаются при других способах фиксации и последующей заливке объектов в парафин. По мнению Б. Ромейса (1954), фиксация чистым ацетоном имеет смысл лишь при необходимости быстрого получения гистологического препарата. Для этого кусочки органов толщиной 1 – 3 мм помещают на 1 – 3 ч в безводный ацетон, переносят на 30 мин в ацетон-бензол (1: 1), затем на 30 – 60 мин в бензол и заливают в парафин. Непосредственный перенос объектов из ацетона в парафин нежелателен, так как последний почти нерастворим в ацетоне.
1.2.2. Этанол
Для фиксации тканей применяют как чистый этиловый спирт, так и различные смеси этанола и других веществ. В практической работе этанол следует применять при фиксации нервной ткани для окраски по Нисслю и при планировании выявления гликогена. В сравнении с формалиновой спиртовая фиксация дает лучшие результаты и при выявлении железа, бактерий, амилоида. В отличие от формалина спирт обладает меньшей проникающей способностью, поэтому для фиксации берут кусочки не толще 0,5 см.
Фиксирующее действие спирта основано, прежде всего, на удалении воды из тканей – обезвоживании. Этот процесс сопровождается коагуляцией белков без существенного нарушения их антигенной структуры. Согласно Б. Ромейсу (1954), в этаноле полностью сохраняется ряд веществ, которые в других жидкостях растворяются целиком или частично. К таким веществам относятся муцины, гликоген, мочевая кислота, железо, кальций. Напротив, жиры и жироподобные вещества, холестериновые соединения растворяются и экстрагируются. В результате потери воды и липидов цитоплазма сильно сморщивается, причем больше, чем ядро клетки. Несмотря на этот недостаток, фиксация спиртом остается незаменимой для многих специальных исследований.
Обычно этанол промышленного производства, доступный для использования в гистологических целях, соответствует двум категориям:
– ректификат, который представляет собой очищенный перегонкой в производственных условиях 95,5 %-й этанол (96 %-й медицинский спирт);
– абсолютный спирт, получаемый в результате ректификации смеси спирта, воды и бензола. Вначале тройной азеотроп указанных компонентов отгоняется до полного удаления воды, затем азеотроп спирта и бензола – до полного удаления бензола.
Получение из 96 %-го этанола абсолютного спирта в лабораторных условиях весьма затруднительно, поэтому авторы не рекомендуют использовать описанные в литературе методики с прокаливанием медного купороса (из-за низкого качества получаемого спирта) и способы с применением негашеной извести и металлического кальция (из-за высокой пожароопасности). В настоящее время денатурированный абсолютный этанол поставляется многими ведущими фирмами – производителями химических реагентов для лабораторных исследований, его могут приобрести организации, имеющие соответствующую лицензию.
Перед использованием этанола следует убедиться в том, что содержание в нем воды соответствует допустимому уровню для соответствующих методов фиксации и дальнейшей обработки материала. Содержание воды проверяют ареометром (спиртометром). При этом важно соблюдать рабочую температуру, указанную на спиртометре.
Обычно для фиксации употребляется безводный, так называемый абсолютный спирт. Хорошие результаты фиксации удается получить в случае, если толщина объектов не превышает 5 мм. Фиксация идет очень быстро. Для очень тонких кусочков достаточно 15 – 30 мин, при толщине 1 – 2 мм – 0,5 – 1,0 ч, при толщине 3 – 4 мм – 2 – 4 ч. Важно, чтобы препараты лежали на толстом слое ваты в большом количестве спирта, а спирт не разбавлялся проникающей из препарата водой, которая при соблюдении указанных условий будет опускаться на дно. Слой ваты создает условия для равномерной фиксации, благодаря которым спирт проникает в препарат со всех сторон.
Действию абсолютного спирта препарат подвергают в течение времени, необходимого для его полного пропитывания. Длительное воздействие абсолютного этанола чрезмерно уплотняет ткани и делает их хрупкими. Плохо пропитывающиеся объекты (особенно ткани беспозвоночных) Б. Ромейс (1954) рекомендует фиксировать в кипящем абсолютном спирте (2 – 10 мин).
Сразу же после окончания фиксации зафиксированные кусочки лучше пропитать и залить (в парафин, целлоидин либо другие среды). Если нет возможности сразу залить фиксированный препарат, то он переносится в терпинеол или 80 %-й этанол, в которых материал может длительно сохраняться без нарушения способности к окраске и резке (Ромейс Б., 1954).
Артефактами спиртовой фиксации являются сильное сморщивание клеток и смещение клеточного и ядерного содержимого, а иногда и самих ядер к середине кусочка (по направлению проникновения фиксатора в объект).