Кевин Дейвис
Редактируя человечество: Революция CRISPR и новая эра изменения генома
Разрезание ДНК при помощи CRISPR. 1. Сканирование: нуклеаза Cas9 связывается с направляющей РНК, образуя рибонуклеопротеидный комплекс. Направляющая состоит из крРНК и трансактивирующей крРНК. Комплекс Cas9 сканирует ДНК в поисках последовательности PAM, которая служит первичным сигналом для проверки совпадения последовательностей. 2. Сцепление: Cas9 связывается с ДНК и расщепляет двойную спираль, позволяя крРНК комплементарно (взаимодополняюще) присоединиться к одной нити ДНК. 3. Разрезание: если ДНК и РНК полностью совпадают, Cas9 претерпевает конформационное изменение, в результате чего обе нити ДНК разрезаются в одном и том же месте. (По материалам пункта 23 примечаний.)
Клетки обладают множеством молекулярных механизмов восстановления разрывов и других мутаций в ДНК. Если бы их не было, нас бы не было в живых. Два наиболее известных механизма называются негомологичным соединением концов (NHEJ) и гомологически направленной репарацией (HDR). NHEJ небрежно сшивает вместе разорванные концы ДНК, что часто приводит к небольшим вставкам или делециям генетического текста в месте восстановления. Это идеально подходит для исследователей, использующих CRISPR для преднамеренного нарушения функции гена путем его нарушения с помощью добавления случайных вставок и делеций. Другой механизм, HDR, при наличии подходящей матрицы производит надежное восстановление. В нормальных условиях матрицей является соответствующий ген на сестринской хромосоме. Прелесть редактирования генома при помощи CRISPR заключается в том, что исследователь может предоставить подходящую матрицу, содержащую желаемую последовательность для восстановления разрыва, вызванного Cas9, что приводит к нужному изменению в определенном месте молекулы ДНК[83][84].
В январе 2020 г. около пятисот ученых собрались в Банфе, горнолыжном курорте на юге канадских Скалистых гор, чтобы провести первую большую конференцию года, посвященную CRISPR. (Она также оказалась и последней, поскольку пандемия COVID-19 лишила желающих возможности ездить на подобные мероприятия.) Организаторы пригласили Дудну выступить с речью на открытии, состоявшемся воскресным утром, – к этой роли она уже привыкла. Она начала с искренних извинений за то, что не сможет остаться и пообщаться с участниками в течение следующих нескольких дней, поскольку ей было необходимо вернуться в Беркли, чтобы в понедельник утром прочитать лекцию для шестисот студентов.
Лекция Дудны, прочитанная с той же скромностью и почтением перед наукой, что были ей свойственны в начале карьеры более трех десятилетий назад, служила биотехнологическим эквивалентом обращения президента США к конгрессу о положении в стране. Основная мысль ее вступительной речи – дани уважения не только ее собственной работе, но и труду множества исследователей за предыдущую четверть века – была простой:
«Прецизионное редактирование генома осуществимо»[85].
Глава 3
Мы можем быть героями
У великих моментов в истории науки и технологий может быть самая неожиданная завязка. В 1966 г. Playtex, компания, создавшая культовый бюстгальтер Cross Your Heart, приняла участие в конкурсе NASA по разработке скафандра для первой высадки «Аполлона» на Луну. Костюмы должны были выдерживать давление и резкие перепады температур. Кроме того, они должны были обладать гибкостью – свойством, которое Playtex продемонстрировала, засняв, как один из технических специалистов компании часами играет в американский футбол в скафандре. В результате четыре швеи Playtex сшили двадцатислойный скафандр A7L, в котором Нил Армстронг прошелся по лунному подиуму[86].
Перенесемся от Моря Спокойствия на Луне к солончакам Санта-Полы у Средиземного моря. Я нахожусь в Аликанте, популярном туристическом курорте на побережье Коста-Бланка на юго-востоке Испании. Вряд ли можно сказать, что здесь самая экстремальная среда обитания на Земле. Однако, проехав примерно двадцать километров на юг, вы доберетесь до Салинас-де-Санта-Пола. Соляные озера, или солончаки, как следует из названия, представляют собой сеть прямоугольных лагун с экстремально высокой концентрацией соли, получившейся в результате сильного воздействия солнца и ветра. По периметру, где вода встречается с сушей, соль кристаллизуется, образуя твердую белую полосу, похожую на идеальный край бокала с коктейлем «Маргарита».
Это место имеет экологическое, историческое и коммерческое значение. Здесь живут фламинго и другие виды животных. Сторожевая башня, построенная в XVI в., служила подданным короля Филиппе II: отсюда они вели наблюдение за маврами. Это место похоже на заповедник, но на самом деле – это промышленная соляная шахта. В каждом озере размером с футбольное поле постоянно концентрируется соль. Сегодня Bras del Port добывает ежедневно из Средиземного моря в среднем около 4000 тонн соли. Горы соли готовы для отправки: около 60 % пойдет на очистку воды, остальное – в пищу.
Для Франсиско Мохики, микробиолога из Университета Аликанте, изучение галофильных организмов, которые процветают в этой своеобразной среде обитания, составляет особую страсть. Там, где он когда-то трудился в безвестности, сегодня изо всех сил стараются избежать внимания СМИ. В 2017 г. ведущая испанская газета El País высказала предположение, что однажды Мохика переберется из солончаков в нобелевские спа-курорты.
Мохика любезно согласился довезти меня на своем неброском Volkswagen Passat до Салинас. Этот путь он проделывает довольно часто, обычно в компании фотографов или съемочных групп, которые просят его изобразить, как он осматривает чистые розовые воды или смотрит сквозь стеклянную емкость с соленой водой на солнце, как в первый раз, будто любуясь бокалом риохи. По счастливому стечению обстоятельств Мохика никогда не собирал образцы для своих собственных исследований, поскольку во времена, когда он был молодым аспирантом, в лаборатории уже имелась груда материалов, собранных его руководителем за предыдущие десять лет.
Впервые Мохика попал на солончаки после того, как закончил военную службу в 1989 г. Он искал работу в качестве научного сотрудника, и вскоре ему предложили должность на кафедре микробиологии местного университета в лаборатории, изучающей микроорганизм под названием «галоферакс». «Меня не особенно интересовали эти организмы. Мой руководитель сам решил вопрос с моей диссертацией», – сообщил он, пока мы гуляли по соляным озерам[87].
Галоферакс – это не бактерией (хотя раньше его ошибочно называли Halobacterium), но принадлежит к особой группе одноклеточных организмов – археям. Невооруженным глазом эти два таксона трудно отличить друг от друга. Но это не согласуется с эволюционной пропастью продолжительностью около трех миллиардов лет. Признание того, что археи – это не просто ответвление от прокариот, но совершенно отдельный «третий домен» живых существ, является результатом плодотворной работы биолога-эволюциониста Карла Вёзе. Секвенирование ДНК выявило поразительные генетические различия между археями и бактериями, подобно тому как операционная система Windows отличается от macОS. Об этом удачно сказал Эд Йонг: «Это все равно, что мы смотрим на карту мира, а Вёзе вежливо объясняет, что треть ее еще не развернули»[88].
Вода выглядит розовой, а соленые корки лагун усыпаны розовато-красными полосами, где кишит микроскопическая жизнь. Красноватый оттенок связан с выработкой каротиноидов – это часть механизма защиты микробов от соли и солнечного света. «Как будто солнцезащитный крем», – смеется Мохика. Цвет меняется в зависимости от степени солености: красный становится розовым при повышении концентрации соли от 10 до 30 %. Те же химические соединения придают оперению фламинго их фирменный розовый оттенок, поскольку они питаются крошечными солоноводными креветками, которые, как и Haloferax, обитают в этих соленых водах в огромном количестве.
Любящие соль археи Аликанте по определению являются экстремофилами – формами жизни, приспособленными для жизни в необычайно суровых условиях, будь то подводные вулканические источники, выжженные пустыни или замерзшая тундра. Для галоферакса концентрации соли в обычной морской воде просто недостаточно. Чтобы жить и развиваться, ему требуется соли в десять раз больше. Воспроизвести подобные условия в лаборатории чрезвычайно трудно, поэтому эти организмы остаются малоизученными по сравнению со своими дальними бактериальными родственниками. Два основных вида галоферакса – это H. mediterranei и H. volcanii (вторые названы так не потому, что они перепутали соляное озеро с кратером вулкана, а в честь открывшего их израильского ученого Бенджамина Вулкани). Я также чувствую присутствие анаэробных бактерий, благодаря сильному сернистому запаху, распространяющемуся над водой.
Одержимость Мохики солелюбивыми микроорганизмами Санта-Полы привела к впечатляющим результатам в его фундаментальных исследованиях. «Это получение знаний через познание, чтобы расширить знания», – говорит он[89]. По мнению Мохики, ключ к загадке любви галофераксов к соли должен заключаться в их кольцевой молекуле ДНК. Это стало ясно не сразу: первая полная последовательность генома микроорганизма была получена только в 1995 г. группой Клэр Фрейзер и Крейга Вентера, которые также первыми расшифровали полный геном архей двумя годами позже. Лаборатория Мохики не была богатым центром геномных исследований с новейшим оборудованием для секвенирования ДНК. В начале 1990-х для многих ученых секвенирование оставалось обременительным ручным процессом, включавшим в себя заливку большого пласта геля между двумя стеклянными пластинами и последующее разделение радиоактивных фрагментов ДНК по размеру с помощью электрического тока. По полученному изображению лэддера (от англ. ladder – «лестница») на чувствительной рентгеновской пленке Мохика мог «читать» последовательность ДНК.
Во время одной из своих первых попыток секвенирования в августе 1992 г. Мохика увидел нечто настолько удивительное, что решил, что все сделал неправильно. Он получил странные повторяющиеся последовательности, каждую длиной около 30 оснований, что он, как и положено, указал в своей первой статье[90]. «Нам просто повезло, – заметил он после секвенирования менее 1 % генома галоферакса. – Это была первая статья, где к CRISPR отнеслись серьезно»[91]. Мохика также обнаружил, что эти повторы, к удивлению, транскрибируются в РНК, что позволяет предположить наличие у них какой-то функции.
«Когда вы видите что-то необычное, у вас нет другого выхода, кроме как исследовать это. Я подумал, что над этим хорошо было бы продолжить работу», – говорит он, пока мы продолжаем прогулку по солончакам. Он догадывался, что загадочные повторы могут быть как-то связаны с адаптацией к концентрации соли, возможно за счет изменения их конфигурации, а следовательно, активности генов, при регистрации колебаний осмотического давления клетки. «В то время суперспирализация [ДНК] была ответом на все вопросы, связанные с регуляцией экспрессии генов!» Это была хорошая гипотеза, но неверная[92].
Работая в университетской библиотеке в неурочное время, Мохика в конце концов обнаружил статью японских ученых за 1987 г. В ней Ацуо Наката и Йосизуми Исино[93] из Университета Осаки описали аналогичный повторяющийся мотив в геноме E. coli. Секвенируя исследуемый ген, японская группа заметила необычную соседнюю последовательность с характерными повторами, похожими на круги на полях, вырезанные на поверхности ДНК. Этот участок состоял из серии (кластера) коротких повторов палиндромной последовательности (читающихся одинаково в прямом и обратном направлении). Повторы, состоящие из двадцати девяти букв, были отделены друг от друга отрезком уникальной последовательности из тридцати двух оснований (спейсерами). Однако, поскольку никто до этого не видел ничего подобного и ничто не говорило об их биологической функции, исследователи не придали этому значения. Команда, как положено, описала и опубликовала свои наблюдения, которые в то время не привлекли к себе внимания[94].
Два года спустя[95] Мохика описал короткую последовательность, повторяющуюся сотни раз в тандемном повторе, охватывающем более 1000 оснований. Между каждой парой таких повторов была уникальная последовательность ДНК с неизвестной функцией. Руководитель Мохики предложил назвать эти повторы, которые также наблюдались у другого экстремофила – архей, любящих вулканы, TREP (от англ. tandem repeats – «тандемные повторы»). Несомненно, должна быть причина, по которой до 2 % драгоценной, компактной ДНК прокариот выделено под эти странные повторы. «Микроорганизмы не могут позволить себе такую роскошь, – думал Мохика. – Они должны выполнять важную функцию»[96].
Другие ученые тоже сталкивались с такими повторами. Немецкий микробиолог Бернд Мазеполь ломал голову над фрагментом ДНК с тринадцатью повторами, найденным в цианобактериях, который он назвал LTRR, что означает «длинное тандемно повторяющееся повторение» (от англ. long tandemly repeated repetitive). Однако, сосредоточившись на этих участках ДНК, Мазеполь не обратил внимания на уникальные последовательности, расположенные между ними[97]. Другая команда также была близка к разгадке тайны повторов ДНК. В 2002 г. Евгений Кунин, российский специалист по вычислительной биологии из Национального центра биотехнологической информации при Национальном институте здравоохранения США, и его коллега Кира Макарова описали серию бактериальных генов, которые, как они подозревали, входят в систему репарации ДНК[98]. Вот только они не поняли, что эти гены располагались рядом с участком CRISPR и, как мы вскоре увидим, играли важную роль в работе CRISPR и в редактировании генов.
После нескольких лет работы в Оксфордском университете Мохика вернулся в Аликанте в 1997 г., чтобы собрать собственную научную группу. Получив небольшое финансирование, Мохика попытался провести несколько недорогих экспериментов, «хотя и понятия не имел о биоинформатике». Вопрос, который не давал покоя, касался происхождения спейсерной ДНК – последовательностей, вкрапленных между повторами. «Искать по базам данных и ждать, когда хоть что-нибудь найдется, несложно, но мы ничего не получали – до 2003 г.». К тому времени базы данных последовательностей ДНК были переполнены геномами бактерий и архей, многие из которых содержали версии этих повторов.
В 2000 г. Мохика переименовал объект своей одержимости в SRSR (от англ. short regularly spaced repeats – «короткие регулярно расположенные повторы»). Это название просуществовало недолго. Позже он обменялся электронными письмами с Руудом Янсеном из Нидерландов, который изучал семейство генов, примыкающих к загадочным повторам. Янсен чувствовал необходимость обозначить открытие как-то иначе, поэтому Мохика предложил CRISPR. 21 ноября 2001 г. Янсен ответил ему, восторженно выразив свое одобрение:
Дорогой Франсис,
Какая замечательная аббревиатура – CRISPR! Я считаю, что каждая буква, которой не хватало в других версиях, делала их менее «хрустящими», поэтому я предпочитаю более энергичный CRISPR, а не SRSR и SPIDR[99].
У CRISPR наконец-то появилось название, как и у группы необычных генов, которые, казалось, были связаны с элементами CRISPR. Янсен разумно, хотя и без всякого воображения, назвал их Cas (от англ. CRISPR-associated – «связанные с CRISPR»). В то время Мохика был все еще сосредоточен на изучении любопытных спейсеров CRISPR.
В конце концов прорыв был совершен красивым вечером в августе 2003 г. Мохика проводил со своей женой отпуск недалеко от дома, около соляных озер. Из-за жары Мохика нашел повод вернуться в лабораторию, оборудованную кондиционером, где он мог провести еще несколько компьютерных поисков. Это было обычным делом, почти как в видеоигре: Мохика копировал последовательность одного из загадочных спейсеров и вводил ее в компьютерную программу BLAST, которая искала совпадения в огромной базе данных ДНК – GenBank. Мохика запускал этот поиск сотни раз, но безрезультатно. Коллеги говорили, что это пустая трата времени. Но в тот день, к его удивлению, компьютер зафиксировал совпадение. Один конкретный спейсер из E. coli соответствовал участку вирусной ДНК под названием P1, который, что важно, инфицирует эту же бактерию. В течение последующих недель Мохика каталогизировал десятки других совпадений между спейсерами CRISPR и различными вирусами.
В октябре Мохика отправил самую важную статью в своей жизни в ведущий журнал – Nature. «Я помню, что заголовок звучал так: "Повторы прокариот участвуют в работе иммунной системы". Чтобы убедить редактора и рецензентов, мы написали, что открытие приобретенной иммунной системы прокариот будет иметь огромное значение для биологии и клинических наук. И каков был результат? Нашу работу даже не рассмотрели!»[100]
Возможно, что-то неверно перевели, но редакторы журнала Nature не нашли эту идею концептуальным достижением, «представляющим достаточный общий интерес», которого заслуживают публикации на его престижных страницах. Мохика подал апелляцию, утверждая, что это первое описание бактериальной иммунной системы с функцией памяти. Сотрудники Nature указали, что они готовы пересмотреть свое решение, если им будет предоставлено описание механизма, лежащего в основе этого свойства иммунитета. Однако группа Мохики не смогла найти экспериментального подтверждения гипотезе. Все, что у них было, – это бесспорное доказательство в виде последовательностей. Одна из причин, как оказалось, заключается в том, что CRISPR не работала в наиболее популярном лабораторном материале, E. coli[101]. Как если бы у Мохики были уличающие вещественные доказательства, но не было видеозаписи с камер наблюдения.
Мохика зализал раны и подал статью на рассмотрение в другой журнал… и еще в другой. Три журнала, включая Proceedings of the National Academy of Sciences (PNAS), отказались от CRISPR. Каждая задержка публикации увеличивала вероятность, что Мохику обойдут конкуренты. Наконец в октябре 2004 г. он отправил рукопись в малоизвестный журнал, специализирующийся на эволюции. Прошло целых полгода, прежде чем он получил одобрение от редактора. Три месяца спустя его статья была принята в печать. «Эти два года были для меня кошмаром, – рассказывает он. – Когда у вас в руках есть что-то настолько сенсационное и вы отправляете это в очень хорошие журналы – и все они решают, что это недостаточно интересно для публикации, – вы думаете, я что, сумасшедший? или здесь что-то не так?»[102]
Многие научные статьи – это коллективные усилия, результат многомесячного, если не многолетнего планирования, анализа и повторения экспериментов, постоянного обмена идеями между учеником и наставником. Если один участник оказывается в центре внимания, другим, справедливо или незаслуженно, может быть обидно.
Вторым из четверых авторов революционной публикации Мохики был аспирант Сезар Диес-Вильясеньор. Он смотрел, как Мохику осыпают почестями, со смесью гордости и зависти. На заре CRISPR «казалось вероятным, что спейсеры вообще не выполняли никакой функции»[103], – вспоминает он, поскольку каждый из них имел уникальную последовательность, что сводило к минимуму вероятность, что они имеют какую-то общую функцию. Однако Диес-Вильясеньор недоумевал: «Если последовательность спейсеров на самом деле не имеет значения, зачем беспокоиться?» Возможно, их уникальность означала, что они были каким-то образом токсичны для подобных последовательностей. «Это предположение было немедленно отклонено, хотя и не давало мне покоя. Она указывала на верное направление», – говорит он с ностальгией. Другая возможность заключалась в том, что спейсеры получились в результате какой-то необычно небрежной репликации ДНК. Но тогда соседние спейсеры должны быть более похожи, чем отстоящие дальше друг от друга, а этого не наблюдалось. Диес-Вильясеньор составил карту спейсеров CRISPR E. coli, отвергая идею мутагенеза. Он вспоминает, что это было за день до того, как Мохика воскликнул: «Эврика!»
«Я сказал с небольшим разочарованием, что спейсеры должны происходить из существующих последовательностей, но, очевидно, эти предсуществующие последовательности должны находиться в это время в клетке». Сказав это вслух, он понял, что это было совершенно логично. «Конечно, это и есть иммунная система!» Интерферирующая РНК играет значительную роль в известных молекулярных механизмах иммунной системы. «Внезапно все, что выглядело так странно, обрело смысл». Диес-Вильясеньор спросил Мохику, прогонял ли он спейсерами последовательности по базам данных. Мохика быстро ответил: «Я это сделаю! Сам ничего не делай».
Открытие иммунной системы микроорганизмов, способной распознать вторгающийся фаг, было очень важным событием. На следующий день сомнения стали рассеиваться. «Франсис пришел в лабораторию в приподнятом настроении и напрямую поговорил со мной. Он сказал, что обнаружил первую гомологию спейсера E. coli в фаге P1». Позже он рассказал другому профессору, что CRISPR были похожи на «памятные вещи из прошлого, состоящие из генетических элементов». По словам Диес-Вильясеньора, это был самый приятный момент в его профессиональной карьере.
Всего через несколько недель после того, как Мохика начал свою публикационную одиссею[104][105], парижский ученый Жиль Верно представил на рассмотрение свою собственную историю о CRISPR и испытал похожие разочарования. В связи с растущим беспокойством по поводу использования Саддамом Хусейном биологического оружия Верно, работающему на Министерство обороны Франции, было поручено усовершенствовать методы обнаружения угрозы микробами. К концу 2002 г. Верно получил доступ к ДНК десятков штаммов Yersinia pestis, выделенной во время вспышки чумы во Вьетнаме в середине 1960-х. Используя лучшие генетические методы, доступные в то время, он обнаружил, что штаммы были идентичны, за исключением одного участка генома, который назвали мини-сателлитом № 6 (MS06). Когда аспирант Грегори Сальвиньоль более подробно проанализировал последовательность MS06, оказалось, что это CRISPR. Более того, команда французских ученых выяснила, что он включал в себя новые спейсеры из вирусной ДНК. Они также предположили, что эти структуры были частью бактериальной иммунной системы. Первый вариант рукописи, написанный в июле 2003 г., включал понятие «защитный механизм» – летописи «прошлых генетических нападений».
Однако, как и Мохика, Верно столкнулся с удручающими отписками. Он подал свою статью – первую, в названии которой было слово CRISPR, – сразу после Мохики, но в ноябре 2003 г. журнал PNAS отклонил ее, не рассматривая. То же самое произошло с журналом Journal of Bacteriology (дважды), Nucleic Acids Research и Genome Research. В июле 2004 г. он отправил свою работу в журнал Microbiology, который наконец опубликовал ее в 2005 г.[106]
История CRISPR была бы другой, если бы любой из этих журналов ответил согласием. Как бы то ни было, Верно в течение трех лет подряд безуспешно подавал заявки на грант Французского национального исследовательского агентства (French National Research Agency). Третья статья о CRISPR была опубликована Александром Болотиным, русским микробиологом, работающим в Министерстве сельского хозяйства Франции. Болотин отметил корреляцию между количеством спейсеров и чувствительностью фагов, сделав вывод, что «спейсерные элементы – это следы прошлых вторжений внехромосомных элементов»[107].
Сегодня нам известно, что элементы CRISPR содержатся почти в 90 % архей и только в 40 % бактерий. Мохика объясняет, что бактерии обладают более обширным набором защитных систем. CRISPR служит своего рода генетическим барьером для микробной эволюции, поскольку препятствует горизонтальному переносу генов. «Вы бы предпочли иметь барьер от передачи генетической информации или защиту от вирусов?» – спрашивает Мохика.
Испания имеет лишь двоих лауреатов Нобелевской премии в области науки – Сантьяго Рамона-и-Кахаля (1906) и Северо Очоа (1959). Это немного удручает Мохику, даже несмотря на то, что он смеется над такими праздными догадками. «Приятно знать, что кто-то думает, что я этого заслуживаю, я очень это ценю, но думать о возможности получения Нобелевской премии – это, можно сказать, безумие! Не бывает такого, чтобы кто-то ожидал получения Нобелевской премии».
Прежде чем вернуться в Аликанте, мы с Мохикой останавливаемся выпить пива перед обедом. Он собирается отправиться в трехнедельный тур по Австралии с лекциями – такого рода карьерный успех, которого жаждет большинство ученых. Я спрашиваю, как он – микробиолог, которому дали прозвище el padrino – «крестный отец», – справляется со своей новообретенной славой. Мохика делает паузу, тянется за очередной оливкой. В ресторане никого нет, но он почти шепотом произносит: «Я ненавижу это… Ненавижу». Я не ожидал такой реакции. «Я просто хочу спокойной жизни, – говорит он, качая головой. – Хочу заниматься своими исследованиями и возвращаться домой к жене».
Любой, кто делает ставки на то, где произойдет следующий поворотный момент в истории CRISPR, обнаружил бы большие шансы у датской компании по производству йогуртов. Однако для ученых из Danisco коммерчески важно сделать так, чтобы бактерии, используемые в заквасочных культурах, могли бороться с постоянной угрозой фаговой инфекции. Следующий прорыв в области CRISPR произошел в двух частях мира, где ценится производство сыра, – во Франции и в Висконсине.
Филипп Хорват родился в пятидесяти милях к югу от Страсбурга, недалеко от границы с Германией. Пока мы идем в ресторан в Вильнюсе в Литве, он останавливается, чтобы посмотреть счет матча чемпионата мира по футболу, который показывают на огромном уличном экране. Хорватия побеждает, приближаясь к своему неожиданному выходу в финал турнира 2018 г. «А знаете ли вы, что моя фамилия переводится с венгерского языка как "из Хорватии"?» – спрашивает Хорват[108]. (Ну откуда же мне это знать?!)
В рамках написания кандидатской диссертации в Страсбургском университете Хорват изучал геном Lactobacillus plantarum – лактобактерии, которую традиционно используют для получения таких ферментированных пищевых продуктов, как опара, кимчи, соленые огурцы и квашеная капуста. Я высказал сомнение, что эта тема не настолько серьезна, чтобы по ней защищать диссертацию, но Хорват пронзил меня взглядом. «Это не обычная бактерия, вроде кишечной палочки», – говорит он строго. Производство квашеной капусты – важный бизнес в Эльзасе, где она составляет основу знаменитого блюда шукрут.
Хорват увидел подходящее объявление о вакансии молекулярного биолога в этой области и отправил первый и последний раз письмо с заявкой о приеме на работу. В декабре 2000 г. ему предложили место в компании Rhodia Food (бывшая Rhone-Poulenc, известная французская химическая компания)[109]. Знания Хорвата о генетике бактерий помогли улучшить качество заквасок – штамма бактерий, используемых в процессе брожения молока для получения йогурта и сыра, которые Rhodia продавала таким пищевым гигантам, как General Mills, Danone и Nestlé. Фаги, которые охотятся на бактерии, используемые при ферментации, естественным образом содержатся в молоке. «Если у вас есть резервуар, содержащий 10 000 литров молока, и вы добавляете закваску, чувствительную к присутствующим фагам, это катастрофа! – говорит Хорват. – Это молоко останется молоком».
Традиционно заквасочная культура состоит из 3–8 штаммов бактерий с высокой плотностью – около 1 трлн бактерий на 1 грамм. В основном используются Lactobacillus acidophilus, Lactococcus lactis и Streptococcus thermophiles. Хорват объясняет, что пакет или брикет сублимированной закваски добавляют примерно в 2000 литров молока. Цель состоит в том, чтобы максимально сократить число циклов деления клеток, необходимых бактериям для выработки достаточного количества молочной кислоты, чтобы снизить рН молока. Подкисление должно происходить быстро, чтобы защитить молоко от вредных бактерий, таких как Salmonella и Listeria. «Чем выше количество бактерий, тем меньше их поколений вам понадобится и тем меньше вы рискуете в отношении фагов», – говорит Хорват. Люди тысячелетиями производили ферментацию молока таким образом, не зная молекулярных тонкостей.
Хотя для покупателей заквасочных культур особенно важны такие их свойства, как подкисление и устойчивость к фагам, они также ценят другие качества, например консистенцию и аромат. «Вы должны быстро подкислять, но вы также должны обеспечить и консистенцию. Вы пробовали жидкий йогурт?» – спрашивает меня Хорват, когда мы собираемся приступить к еде. «Он получился благодаря фагам, которые убили наш штамм, формирующий консистенцию». Группа Хорвата разработала заквасочные культуры для множества процессов ферментаций, в том числе более чем для 1000 различных французских сыров. Закваска для сыра, используемого в пицце, сильно отличается от той, что применяется в производстве камамбера. А поскольку фаги могут появиться в любое время, группе Хорвата приходится разрабатывать разные заквасочные культуры для одного и того же продукта с чувствительностью к разным фагам.
В основном работа Хорвата связана с отбором дочерних штаммов, не восприимчивых к фагам, атакующим исходный штамм. Процесс подразумевает обычное выживание сильнейших: добавьте фаг к чувствительному штамму в лаборатории, терпеливо ждите и ищите выживших. Мутантов, возникающих естественным образом, называют нечувствительными к бактериофагу мутантами (BIM). Выживают они, возможно, в результате того, что фаг не смог прикрепиться к поверхности бактериальной клетки.
В сентябре 2002 г., на симпозиуме по молочнокислым бактериям в Нидерландах, Хорвату попался на глаза постер, представленный Александром Болотиным. В нем упоминался повторяющийся мотив ДНК, названный SPIDR (от англ. spaced interspersed direct repeats – «разнесенные диспергированные прямые повторы»): позже он будет переименован в CRISPR. «Мы определили область с повторами, которая очень полезна для идентификации штаммов», – заявлял Болотин. Хорват был так заинтригован, что тайком сделал фотографию постера.
Вернувшись в лабораторию, Хорват сравнил последовательность одного из штаммов Streptococcus (LMD-9), с которым работала его собственная группа, со штаммом, который изучал Болотин, а также другими штаммами. К радости Хорвата, в областях с повторами SPIDR наблюдалось огромное разнообразие спейсеров. Каждый штамм отличался от других и как будто имел отпечатки пальцев в виде различных последовательностей ДНК. Хорват заметил кое-что еще: некоторые последовательности, чередующиеся с повторами SPIDR, совпадали с ДНК вирусов, что говорило о связи между спейсерами и фагами. «Сравнив последовательности спейсеров с известными [вирусными] последовательностями, мы заметили сходство с фаговыми последовательностями. Да, в 2003 г.!» В то время к повторам CRISPR небольшой интерес проявляли только Мохика и несколько других исследователей. Хорват тщетно пытался заинтересовать своих руководителей проектом, который он назвал CRISPy-SPIDRs[110], но в пищевом подразделении химической компании едва ли могли найтись сторонники изучения малопонятной биологии вирусов. «Нас попросили остановить работу над этим», – говорит Хорват. Он продолжил изучать CRISPR вне рабочего времени, выполняя поиск последовательностей на компьютере точно так же, как это делал Мохика.