Вера Александровна Подколзина
Медицинская микробиология: конспект лекций для вузов
3. Метаболизм бактерий
Метаболизм (обмен веществ) бактерий представляет собой совокупность двух взаимосвязанных противоположных процессов катаболизма и анаболизма.
Катаболизм (диссимиляция) – распад веществ в процессе ферментативных реакций и накопление выделяемой при этом энергии в молекулах АТФ.
Анаболизм (ассимиляция) – синтез веществ с затратой энергии.
Особенности метаболизма у бактерий состоят в том, что:
• его интенсивность имеет достаточно высокий уровень, что возможно обусловлено гораздо большим соотношением поверхности к единице массы, чем у многоклеточных;
• процессы диссимиляции преобладают над процессами ассимиляции;
• субстратный спектр потребляемых бактериями веществ очень широк – от углекислого газа, азота, нитритов, нитратов до органических соединений, включая антропогенные вещества – загрязнители окружающей среды (обеспечивая тем самым процессы ее самоочищения);
• бактерии имеют очень широкий набор различных ферментов – это также способствует высокой интенсивности метаболических процессов и широте субстратного спектра.
Ферменты бактерий по локализации делятся на 2 группы:
• экзоферменты – ферменты бактерий, выделяемые во внешнюю среду и действующие на субстрат вне клетки (например, протеазы, полисахариды, олигосахаридазы);
• эндоферменты – ферменты бактерий, действующие на субстраты внутри клетки (например, ферменты, расщепляющие аминокислоты, моносахара, синтетазы).
Синтез ферментов генетически детерминирован, но регуляция их синтеза идет за счет прямой и обратной связи, т. е. для одних – репрессируется, а для других – индуцируется субстратом. Ферменты, синтез которых зависит от наличия соответствующего субстрата в среде (например, бета-галактозидаза, бета-лактамаза), называются индуцибельными.
Другая группа ферментов, синтез которых не зависит от наличия субстрата в среде, называется конститутивными (например, ферменты гликолиза). Их синтез имеет место всегда, и они всегда содержатся в микробных клетках в определенных концентрациях.
Изучают метаболизм бактерий с помощью физико-химических и биохимических методов исследования в процессе культивирования бактерий в определенных условиях на специальных питательных средах, содержащих то или иное соединение в качестве субстрата для трансформации. Такой подход позволяет судить об обмене веществ путем более детального изучения процессов различных видов обмена (белков, углеводов) у микроорганизмов.
Вопрос 5. Особенности белкового и углеводного обмена у бактерий
1. Белковый обмен
Белковый обмен у бактерий – это, с одной стороны, – процесс синтеза собственных аминокислот и белков путем ассимиляции необходимых компонентов из внешней среды, а с другой, – внеклеточное расщепление белков под воздействием различных ферментов. Если расщепление белков происходит в анаэробных условиях, то этот процесс называется гниение, а если он идет в аэробных условиях – тление.
При наличии у бактерий протеаз белки расщепляются ими до промежуточных продуктов распада – пептонов, а при наличии у бактерий пептидаз пептоны расщепляются ими до аминокислот и продуктов их распада (аммиака, сероводорода, индола). Протеолитические (способность расщеплять белки) и пептолитические (способность расщеплять пептоны) свойства выражены далеко не у всех бактерий, поэтому их изучение в совокупности с другими ферментативными свойствами помогает идентифицировать бактерии.
2. Углеводный обмен
Углеводный обмен у бактерий также носит двоякий характер – это процесс синтеза и распада углеводов. Расщепление углеводов бактериями (сахаролитические свойства) в аэробных условиях с образованием углекислого газа и воды называется горением, а расщепление ими углеводов в анаэробных условиях – брожением.
В зависимости от характера конечных продуктов разложения углеводов в анаэробных условиях различают брожение:
• спиртовое,
• молочнокислое,
• пропионовокислое,
• муравьинокислое,
• маслянокислое,
• уксуснокислое.
Молекулярный кислород в процессах брожения не участвует. Большинство бактерий, осуществляющих брожение – облигатные анаэробы. Однако некоторые из них – факультативные анаэробы, способны осуществлять процесс брожения в присутствии кислорода, но без его участия. Более того, этот кислород подавляет процесс брожения. И оно сменяется горением (дыханием – конечный акцептор водорода – кислород). Этот эффект был назван эффектом Пастера и является одним из классических примеров смены метаболизма у бактерий в зависимости от условий среды.
3. Типы биологического окисления у бактерий
Синтез биополимеров бактериальной клетки требует энергии. Она образуется в ходе биологического окисления и запасается в виде молекул макроэргов – АТФ и АДФ.
Органеллами дыхания у большинства бактерий являются производные цитоплазматической мембраны – мезосомы, на которых локализуются специальные дыхательные ферменты типа цитохромоксидаз. Тип биологического окисления является одним из ключевых признаков, позволяющих дифференцировать различные микроорганизмы. По этому признаку выделяют три группы бактерий:
• первая группа – облигатные аэробы, которые способны получать энергию только путем дыхания и нуждаются в молекулярном кислороде как конечном акцепторе электронов. Для них как тип окислительно-восстановительных процессов характерно окисление, при котором конечным акцептором электронов является кислород.
• вторая группа – облигатные анаэробы – бактерии, способные расти только в среде, лишенной кислорода. Для них как тип окислительно-восстановительных процессов характерна ферментация, при которой происходит перенос электронов от субстрата-донора к субстрату-акцептору.
• третья группа – факультативные анаэробы – бактерии, способные расти как в присутствии, так и в отсутствии кислорода, и использовать в качестве терминальных акцепторов электронов как молекулярный кислород, так и органические соединения.
Среди них могут быть факультативно-анаэробные бактерии, способные переключаться с окисления на ферментацию (энтеробактерии), а также аэротолерантные факультативно-анаэробные бактерии, которые могут расти в присутствии атмосферного кислорода, но не используют его, а получают энергию исключительно с помощью брожения (например, молочнокислые бактерии).
Вопрос 6. Рост и размножение. Генетика бактерий
1. Рост и размножение бактерий
Для микробиологической диагностики, изучения микроорганизмов и в биотехнологических целях микроорганизмы культивируют на искусственных питательных средах.
Под ростом бактерий понимают увеличение массы клеток без изменения их числа в популяции как результат скоординированного воспроизведения всех клеточных компонентов и структур.
Увеличение числа клеток в популяции микроорганизмов обозначают термином «размножение». Оно характеризуется временем генерации (интервал времени, за который число клеток удваивается) и таким понятием, как концентрация бактерий (число клеток в 1 мл).
В отличии от митотического цикла деления у эукариотов, размножение большинства прокариотов (бактерий) идет путем бинарного деления, а актиномицетов – почкованием. При этом все прокариоты существуют в гаплоидном состоянии, поскольку молекула ДНК представлена в клетке в единственном числе.
2. Бактериальная популяция. Колония
При изучении процесса размножения бактерий необходимо учитывать, что бактерии всегда существуют в виде более или менее многочисленных популяций, и развитие бактериальной популяции в жидкой питательной среде в периодической культуре можно рассматривать как замкнутую систему. В этом процессе выделяют 4 фазы:
• 1-я – начальная, или лаг-фаза, или фаза задержки размножения, она характеризуется началом интенсивного роста клеток, но скорость их деления остается невысокой;
• 2-я – логарифмическая, или лог-фаза, или экспоненциальная фаза, она характеризуется постоянной максимальной скоростью деления клеток и значительным увеличением числа клеток в популяции;
• 3-я – стационарная фаза, она наступает тогда, когда число клеток в популяции перестает увеличиваться. Это связано с тем, что наступает равновесие между числом вновь образующихся и гибнущих клеток. Число живых бактериальных клеток в популяции на единицу объема питательной среды в стационарной фазе обозначается как М-концентрация. Этот показатель является характерным признаком для каждого вида бактерий;
• 4-я – фаза отмирания (логарифмической гибели), которая характеризуется преобладанием в популяции числа погибших клеток и прогрессивным снижением числа жизнеспособных клеток популяции.
Прекращение роста численности (размножения) популяции микроорганизмов наступает в связи с истощением питательной среды и/или накоплением в ней продуктов метаболизма микробных клеток. Поэтому, удаляя продукты метаболизма и/или заменяя питательную среду, регулируя переход микробной популяции из стационарной фазы в фазу отмирания, можно создать открытую биологическую систему, стремящуюся к устранению динамического равновесия на определенном уровне развития популяции. Такой процесс выращивания микроорганизмов называется проточным культивированием (непрерывная культура). Рост в непрерывной культуре позволяет получать большие массы бактерий при проточном культивировании в специальных устройствах (хемостатах и турбидистатах) и используется при производстве вакцин, а также в биотехнологии для получения различных биологически активных веществ, продуцируемых микроорганизмами.
Для изучения метаболических процессов на протяжении цикла клеточного деления возможно также использование синхронных культур. Синхронные культуры – культуры бактерий, все члены популяции которых находятся в одной фазе цикла. Это достигается с помощью специальных методов культивирования, однако через несколько одновременных делений синхронизированная клеточная суспензия постепенно снова переходит к асинхронному делению, так что число клеток увеличивается в дальнейшем уже не ступенчато, а непрерывно.
При культивировании на плотных питательных средах бактерии образуют колонии. Это – видимое невооруженным глазом скопление бактерий одного вида, являющееся чаще всего потомством одной клетки. Колонии бактерий разных видов отличаются:
• формой,
• величиной,
• прозрачностью,
• цветом,
• высотой,
• характером поверхности,
• краев,
• консистенцией.
Характер колоний – один из таксономических признаков бактерий.
3. Генетика бактерий
Важнейшим признаком живых организмов являются изменчивость и наследственность. Основу наследственного аппарата бактерий, как и всех других организмов, составляет ДНК (у РНК-содержащих вирусов – РНК).
Наряду с этим наследственный аппарат бактерий и возможности его изучения имеют ряд особенностей. Прежде всего, бактерии – гаплоидные организмы, т. е. они имеют одну хромосому. В связи с этим при наследовании признаков отсутствует явление доминантности. Бактерии обладают высокой скоростью размножения, в связи с чем за короткий промежуток времени (сутки) сменяется несколько десятков поколений бактерий. Это дает возможность изучать огромные по численности популяции и достаточно легко выявлять даже редкие по частоте мутации.
Наследственный аппарат бактерий представлен хромосомой. У бактерий она одна. Если и встречаются клетки с двумя, четырьмя хромосомами, то они одинаковые. Хромосома бактерий – это молекула ДНК. Длина этой молекулы достигает 1,0 мм и, чтобы «уместиться» в бактериальной клетке, она не линейная, как у эукариотов, а суперспирализована в петли и свернута в кольцо. Это кольцо в одной точке прикреплено к цитоплазматической мембране.
На бактериальной хромосоме располагаются отдельные гены. У кишечной палочки, например, их более 2 тысяч. Однако генотип (геном) бактерий представлен не только хромосомными генами. Функциональными единицами генома бактерий, кроме хромосомных генов являются IS-последовательности, транспозоны и плазмиды.
Вопрос 7. Функциональные единицы генома. Изменчивость бактериальной клетки
1. Функциональные единицы генома
IS-последовательности – короткие фрагменты ДНК. Они не несут структурных (кодирующих тот или иной белок) генов, а содержат только гены, ответственные за транспозицию (способность IS-последовательностей перемещаться по хромосоме и встраиваться в различные ее участки). IS-последовательности одинаковы у разных бактерий.
Транспозоны. Это молекулы ДНК – более крупные, чем IS-последовательности. Помимо генов, ответственных за транспозицию, они содержат и структурный ген, кодирующий тот или иной признак. Транспозоны легко перемещаются по хромосоме. Их положение сказывается на экспрессии как их собственных структурных генов, так и соседних хромосомных. Транспозоны могут существовать и вне хромосомы, автономно, но не способны к автономной репликации.
Плазмиды — это кольцевые суперспиралевидные молекулы ДНК. Их молекулярная масса колеблется в широких пределах и может быть в сотни раз больше, чем у транспозонов. Плазмиды содержат структурные гены, наделяющие бактериальную клетку разными, весьма важными для нее свойствами:
• R-плазмиды – лекарственной устойчивостью,
• Col-плазмиды – синтезировать колицины,
• F-плазмиды – передавать генетическую информацию,
• Hly-плазмида – синтезировать гемолизин,
• Tox-плазмида – синтезировать токсин,
• плазмиды биодеградации – разрушать тот или иной субстрат и другие.
Плазмиды могут быть интегрированы в хромосому (в отличие от IS-последовательностей и транспозонов, встраиваются в строго определенные участки), а могут существовать автономно. В этом случае они обладают способностью к автономной репликации, и именно поэтому в клетке может быть 2, 4, 8 копий такой плазмиды.
Многие плазмиды имеют в своем составе гены трансмиссивности и способны передаваться от одной клетки к другой при конъюгации (обмене генетической информацией). Такие плазмиды называются трансмиссивными.
2. Фактор фертильности
Наличие F-плазмиды (фактор фертильности, половой фактор) придает бактериям функции донора, и такие клетки способны передавать свою генетическую информацию другим, F-клеткам. Таким образом, наличие F-плазмиды является генетическим выражением пола у бактерий. С F-плазмидой связана не только донорская функция, но и некоторые другие фенотипические признаки. Это, в первую очередь, наличие F-пилей (половых ресничек), с помощью которых и устанавливается контакт между донорскими и реципиентными клетками. Через их канал и передается донорская ДНК при рекомбинации. На половых ресничках расположены рецепторы для мужских fi-фагов. F-клетки не имеют таких рецепторов и не чувствительны к таким фагам.
Таким образом, наличие F-ресничек и чувствительность к fi-фагам можно рассматривать как фенотипическое выражение (проявление) пола у бактерий.
3. Изменчивость
У бактерий различают два вида изменчивости – фенотипическую и генотипическую.
Фенотипическая изменчивость – модификации – не затрагивает генотип. Модификации затрагивают большинство особей популяции. Они не передаются по наследству и с течением времени затухают, т. е. возвращаются к исходному фенотипу через большее (длительные модификации) или меньшее (кратковременные модификации) число поколений.
Генотипическая изменчивость затрагивает генотип. В ее основе лежат мутации и рекомбинации.
Мутации бактерий принципиально не отличаются от мутаций эукариотических клеток. Особенностями мутаций у бактерий является относительная легкость их выявления, так как имеется возможность работать с большими по численности популяциями бактерий. По происхождению мутации могут быть:
• спонтанными,
• индуцированными.
По протяженности:
• точечные,
• генные,
• хромосомные мутации.
По направленности:
• прямые,
• обратные мутации.
Рекомбинации у бактерий отличаются от рекомбинаций у эукариот:
• Во-первых, у бактерий имеется несколько механизмов рекомбинаций (обмена генетическим материалом).
• Во-вторых, при рекомбинациях у бактерий образуется не зигота, как у эукариот, а мерозигота (несет полностью генетическую информацию реципиента и часть генетической информации донора в виде дополнения).
• В третьих, при рекомбинациях у бактериальной клетки-рекомбината изменяется не только качество, но и количество генетической информации.
Трансформация – это обмен генетической информацией у бактерий путем введения в бактериальную клетку-реципиент готового препарата ДНК (специально приготовленного или непосредственно выделенного из клетки-донора). Чаще всего передача генетической информации происходит при культивировании реципиента на питательной среде, содержащей ДНК донора.
Для восприятия донорской ДНК при трансформации клетка-реципиент должна находится в определенном физиологическом состоянии (компетентности), которое достигается специальными методами обработки бактериальной популяции. При трансформации передаются единичные (чаще один) признаки. Трансформация является самым объективным свидетельством связи ДНК или ее фрагментов с тем или иным фенотипическим признаком, поскольку в реципиентную клетку вводится чистый препарат ДНК.
Трансдукция – это обмен генетической информацией у бактерий путем передачи ее от донора к реципиенту с помощью умеренных (трансдуцирующих) бактериофагов.
Трансдуцирующие фаги могут переносить один или более генов (признаков). Трансдукция бывает:
• специфической (переносится всегда один и тот же ген),
• неспецифической (передаются разные гены).
Это связано с локализацией трансдуцирующих фагов в геноме донора. В первом случае они располагаются всегда в одном месте хромосомы, во втором – их локализация непостоянна.
Конъюгация – это обмен генетической информацией у бактерий путем передачи ее от донора к реципиенту при их прямом контакте.
После образования между донором и реципиентом конъюгационного мостика одна нить ДНК-донора поступает по нему в клетку-реципиент. Чем дольше контакт, тем большая часть донорской ДНК может быть передана реципиенту. Основываясь на прерывании конъюгации через определенные промежутки времени, можно определить порядок расположения генов на хромосоме бактерий – построить хромосомные карты бактерий (картирование бактерий). Донорской функцией обладают F+ клетки.
Вопрос 8. Нормальная микрофлора тела человека
1. Понятие о микробиоценозе
Нормальная микрофлора сопутствует своему хозяину на протяжении всей его жизни. О существенном ее значении в поддержании жизнедеятельности организма свидетельствуют наблюдения за животными-гнотобионтами (лишенными собственной микрофлоры), жизнь которых существенно отличается от таковой нормальных особей, а порою просто невозможна. В этой связи учение о нормальной микрофлоре человека и ее нарушениях представляет собой весьма существенный раздел медицинской микробиологии.
В настоящее время твердо установленным является положение о том, что организм человека и населяющие его микроорганизмы – это единая экосистема. С современных позиций нормальную микрофлору следует рассматривать как совокупность множества микробиоценозов, характеризующихся определенным видовым составом и занимающих тот или иной биотип в организме. В любом микробиоценозе следует различать постоянно встречающиеся виды микроорганизмов – характерные (индигенная, автохтонная флора), добавочные и случайные – транзиторные (аллохтонная флора). Количество характерных видов относительно невелико, но численно они всегда представлены наиболее обильно. Видовой состав транзиторных микроорганизмов разнообразен, но они немногочисленны.
Поверхности кожи и слизистых оболочек тела человека обильно заселены бактериями. При этом количество бактерий, населяющих покровные ткани (кожу, слизистые оболочки), во много раз превосходит число собственных клеток хозяина. Количественные колебания бактерий в биоценозе могут достигать для некоторых бактерий нескольких порядков и, тем не менее, укладываются в принятые нормативы. Сформировавшийся микробиоценоз существует как единое целое, как сообщество объединенных пищевыми цепями и связанных микроэкологией видов.
Совокупность микробных биоценозов, встречающихся в организме здоровых людей, составляет нормальную микрофлору человека. В настоящее время нормальную микрофлору рассматривают как самостоятельный экстракорпоральный орган. Он имеет характерное анатомическое строение (биопленка) и ему присущи определенные функции. Установлено, что нормальная микрофлора обладает достаточно высокой видовой и индивидуальной специфичностью и стабильностью.
